흰다리새우의 성장성과 면역 활성에 면역유도된 두토막눈썹참갯지렁이가 미치는 영향

Ⅰ. 서 론

지구상의 모든 생물은 자신을 환경으로부터 보호할 수 있는 면역 체계를 가지고 있으며, 병원성 미생물에 대한 1차 방어 기작으로써 항균 활성을 가지는 다양한 생리 활성 물질을 생산한다(Zasloff, 2002). 이 중 항균펩타이드는 바이러스, 박테리아, 곰팡이 등 다양한 병원체에 대해 항균활성을 나타내어 선천 면역반응에서 중요한 역할을 담당하고 있으며 지구상의 거의 모든 생물에서 발견되는 천연 항생제이다(Patrzykat and Douglas, 2003). 특히 갯지렁이나 새우 등과 같은 해양 무척추동물은 항체에 의한 후천면역 체계가 대부분 결핍되어 있으므로 세포나 체액 성분에 기초한 선천면역에 의존하기 때문에 항균펩타이드의 중요성은 더욱 크다(Boman, 1995; Dimarcq et al., 1998).

항균펩타이드는 항생제와 기능이 유사할 뿐만 아니라 chemokine 및 cytokine 조절, 염증 반응 조절 등의 면역 강화 효과가 있다고 알려져 있기 때문에(Bowdish et al., 2005), Nile tilapia (Oreochromis niloticus), hybrid tilapia (O. niloticus × O. aureus), common carp (Cyprinus carpio) 등 다양한 어종에서 항균펩타이드를 사료 첨가물로 사용하기 위한 연구가 수행되고 있다(Zhou et al., 2008; Lin et al., 2014; Zahran et al., 2019). 이러한 연구들은 사료에 항균펩타이드를 첨가하여 급이하면 성장율, 면역 반응, 항산화능, 면역관련 유전자의 발현에 영향을 미치며, 폐사율을 감소시키고 병원체 감염에 대한 예방효과도 있다고 보고하였다. 이러한 항균펩타이드의 역할을 고려하면 항균펩타이드가 새우의 면역력에도 긍정적인 영향을 미칠 수 있을 것이다.

흰다리새우(Litopenaeus vannamei)는 국내에서 많이 양식되는 종이며 식재료로써 인기가 많은 종이다. 주로 고밀도로 양식되는 흰다리새우는 TSV (Taura Syndrome Virus), WSSV (White Spot Syndrome Virus), Vibrio sp. 등에 의한 전염성 질병에 취약하며(Mohney et al., 1994; Lin et al., 2012) 그로 인한 폐사 피해가 꾸준히 발생하고 있다. 앞서 기술한 항균펩타이드의 역할과 연구들을 고려하였을 때, 사료에 항균펩타이드를 첨가하여 흰다리새우에 급이함으로써 흰다리새우의 면역력을 증강시킨다면 병원체에 의한 피해를 감소시키는 데에 보다 효율적인 방안이 될 수 있을 것이다.

따라서 이번 연구에서는 새우 양식용 사료에 첨가할 수 있는 기존의 항균제 대체 물질로써 해양생물 유래의 유용물질들 중에서도 새우의 먹이가 될 수 있는 갯지렁이를 이용하고자 하였다. 두토막눈썹참갯지렁이(Perinereis linea)에 peptidoglycan (PGN)과 chitosan을 주사하여 효과적으로 항균펩타이드 발현을 유도시키는 자극제를 찾고, 해당 자극제로 갯지렁이를 자극한 후 그 분말을 사료에 첨가하여 흰다리새우에 미치는 영향을 확인하였다.

Ⅱ. 연구 방법

1. 갯지렁이 면역유도

면역유도는 <Table 1>에 표기한 8가지 성분으로 실시하였으며 각 용매에 녹인 면역유도제를 P. linea에 개체 당 100 µL (0.1 µg/worm)을 세 군데로 나누어 주사한 후 18℃에서 18시간동안 면역유도를 시켰다.

<Table 1>

Immune-inducers used in this study

2. 항균펩타이드 발현 확인

면역유도된 갯지렁이의 장기 전체를 적출하여 TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, USA) 방법으로 total RNA를 추출한 후 first-strand cDNA synthesis kit (Takara, Shiga, Japan)을 사용하여 cDNA로 합성하였다. 이후 각 면역 유도제 자극에 대한 총 6가지의 항균펩타이드의 발현 양상을 정량적 실시간 중합효소연쇄반응(qRT-PCR)을 통해 확인하였다. P. linea에서 동정된 bactericidal permeability-increasing (BPI), BPI 2, BPI 3 protein, lipopolysaccharide-binding protein (LBP) / BPI, peptideglycan recognition protein S2 (PGRP-S2), theromacin의 총 6가지 항균펩타이드의 발현 경향을 파악하기 위해 <Table 2>에 표기한 primer를 사용하여 qRT-PCR을 수행하였으며 house keeping gene으로 P. linea의 actin gene을 선택하였다. 실험은 3반복 수행되었으며 cycle threshold (Ct) value는 2^-ΔΔCT 방법으로 계산되었다.

<Table 2>

qRT-PCR primer sets used in this study

3. 사료 제작

Ⅱ-2에서 도출된 결과를 통해 P. linea의 항균펩타이드가 가장 많이 발현되도록 하는 유도제를 선택하여 갯지렁이를 동일한 방법으로 자극하고 18℃에서 18시간동안 면역유도 시킨 후 -80℃에서 24시간동안 냉동하였다. 냉동된 갯지렁이는 48시간 동안 동결건조시켰고 이후 믹서기를 사용하여 곱게 갈았다. 제작된 갯지렁이 분말은 0%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%의 비율로 사료 분말에 첨가하였으며 정량적으로 혼합하여 가공하였다. 사료 조성은 <Table 3>에 나타내었으며 급이시까지 4℃에서 냉장보관 하였다.

<Table 3>.

Formulation and proximate composition of diets used in experiment for P. vannamei

Ⅲ. 연구 결과

1. 면역유도제 자극 후 항균펩타이드 발현

BPI mRNA (MH181387.1)의 발현은 다양한 PGN으로 자극하였을 때 대조군에 비해 유의하게 감소한 반면 crab의 키토산으로 자극하였을 때 2.08배 증가하였다(p < 0.01) ([Fig. 1-A]). BPI 2 (MH181388.1)와 BPI 3 (MH181389.1)의 mRNA 발현은 모든 면역 유도제에 대해 대조군과 유의한 차이가 나타나지 않았다(p > 0.05) ([Fig. 1-B, C]). LBP/BPI mRNA (MH181390.1)의 경우 Streptomyces sp.와 M. luteus의 PGN으로 자극하는 경우 대조군에 비해 각각 4.13배, 3.45배 유의하게 발현이 증가하였으나(p < 0.01) 키토산 자극 시에는 유의하게 감소하였다(p < 0.01) ([Fig. 1-D]). PGRP-S2 (MW353406.1)와 theromacin (MH18138.1)의 mRNA는 M. luteus의 PGN으로 자극하는 경우 각각 7.17배, 51.89배로 크게 증가한 발현양상을 나타내었다(p < 0.01) ([Fig. 1-E, F]). 따라서 M. luteus의 PGN은 P. linea에서 다양한 항균펩타이드를 발현하는 데 가장 효과적인 제제임을 확인하였다.

[Fig 1.]

Detection of mRNA of BPI (A), BPI 2 (B), BPI 3 (C), LBP/BPI (D), PGRP S2 (E) and Theromacin (F) in P. linea after stimulation with eight immune-inducing agents. Levels of AMPs transcripts were quantified relative to that of actin levels. The asterisks represent significant differences compared with the control samples by one-way ANOVA (*p < 0.05, **p < 0.01).

2. 성장성과 생존율

실험종료 후 대조군의 WG는 116.1%였고 M. luteus PGN으로 면역유도된 갯지렁이 분말을 첨가한 실험구는 132.2-139.2% (0.05%: 134.0%; 0.1%: 132.2%; 0.5%: 133.6%; 1%: 139.2%)로 확인되었고 대조군에 비해 유의하게 높은 수치였으나 실험군 사이에서 유의한 차이는 없었다(p > 0.05). 대조군의 FCR은 2.29로 가장 높았고 갯지렁이 분말 첨가 농도에 따라 낮았다(0.05%: 2.03; 0.1%: 1.99; 0.5%: 1.91; 1%: 1.8). 대조군의 PER은 1.07로 가장 낮았고 실험군은 1.21-1.39로 대조군보다 유의하게 높았다(0.05%: 1.21; 0.1%: 1.24; 0.5%: 1.30; 1%: 1.39). 실험기간 중 생존율은 88.1-92.4%(0%: 91.9%; 0.05%: 88.1%; 0.1%: 92.4; 0.5%: 91.0%; 1%: 91.0%)였으며 모든 구간에서 유의한 차이는 없었다(p > 0.05) (<Table 4>).

<Table 4>

Analysis of growth performances and survival rate of whiteleg shrimp fed for 8 weeks

3. 혈청성분 분석

총 8주간의 사육기간 동안 실험종의 혈청화학성분 분석결과, 혈청 내 GLU, ALT, AST, TCHO를 포함한 4가지의 혈청성분 수치는 대조구(0%)와 비교하여 모든 구간에서 유의한 차이를 보이지 않았다(p > 0.05) (<Table 5>). 숙주 선천면역의 지표로 알려진 혈청 라이소자임 활성을 분석한 결과, 모든 실험구에서 대조구와 비교하여 유의한 차이를 나타내지 않았지만(p > 0.05), P. linea 분말 1% 첨가 실험구에서 6주차와 8주차의 라이소자임 활성이 가장 높게 나타났다([Fig. 2]). 실험기간 중 흰다리새우의 스트레스 변화를 확인하기 위하여 그 지표로서 혈청 내 코르티졸의 농도를 분석한 결과, 모든 실험구에서 대조구와 비교하여 유의한 차이를 나타내지 않았다 (p > 0.05) ([Fig. 3]).

<Table 5>.

Serum component analysis of P. vannamei during experimental feeding period

[Fig 2.]

Lysozyme activity analysis of the plasma from L. vannamei during experimental feeding period. The change in absorbance was measured at 570 nm for 1 hour, and a value of 0.001 decrease per 1 minute in absorbance was defined as 1 unit. Data are presented as the mean ± SD from each sample. The asterisks represent significant differences compared with the control samples by one-way ANOVA (*p < 0.05).

[Fig 3.]

Cortisol concentration in the plasma of L. vannamei during experimental feeding period. Data are presented as the mean ± SD from each sample. The asterisks represent significant differences compared with the control samples by one-way ANOVA.

4. 인위감염 후 누적폐사율

모든 사육실험이 종료된 후, P. linea 분말이 실험종의 항병력에 미치는 영향을 확인하기 위해 병원성 세균을 인위감염 시켜 폐사율을 확인하였다. V. harveyi를 인위감염 시킨 흰다리새우는 대조구와 비교하여 1% 실험구를 제외한 실험구에서 유의한 차이는 나타나지 않았지만 (p > 0.05), 그 중 0.05%의 실험구에서 가장 낮은 누적 폐사율이 관찰되었다. 1% 실험구는 5일차에 대조구와 비교하여 누적 폐사율이 유의적으로 높았다. 10일차 누적 폐사율은 대조구에서 33.3%, 0.05%의 실험구에서 26.7%로 대조구보다 낮았다. 하지만 그 외 0.1%, 0.5%, 1%의 실험구에서는 각각 40.0%, 60.0%, 66.7%의 누적 폐사율로 대조구 보다 높았다. 하지만 최종적으로 20일차의 폐사율은 대조군과 비교하여 모든 실험군에에서 유의한 차이가 나타나지 않았고(p > 0.05), 0.05% 실험군의 폐사율이 가장 낮았다([Fig. 4]).

[Fig 4.]

The cumulative mortality rate of L. vannamei by V. harveyi infection after experimental feeding period. Data are presented as the mean ± SD from three tanks. The asterisks represent significant differences compared with the control samples by one-way ANOVA (**p < 0.01).

Ⅳ. 고 찰

이번 연구에서는 PGN과 chitosan을 면역유도제로 사용하였다. PGN은 세균의 세포벽을 구성하는 요소이며 pathogen-associated molecular pattern (PAMP)의 대표적인 예이다. PGN은 선천면역 수용체의 직접적인 target이 되기 때문에 숙주의 선천면역반응에 영향을 주는 것으로 알려져 있다(Wolf and Underhill, 2018). Chitosan 또한 숙주의 선천면역반응을 유도할 수 있는 면역조절제로 사용가능하며 Saltykova et al.(2010a,b)의 연구에 따르면, 꿀벌의 defensin과 abaecin이라는 항균펩타이드의 발현을 증가시킬 수 있다. 실험에 사용된 두토막눈썹참갯지렁이의 항균펩타이드를 효과적으로 유도하는 자극제로는 M. luteus의 PGN이 선택되었기에 이 PGN으로 두토막눈썹참갯지렁이를 자극하여 항균펩타이드 생성을 유도한 후 분말화하여 사료에 농도별로 첨가하고 흰다리새우에 8주간의 사료 급이를 통해 나타나는 성장성, 혈청학적 변화와 항병력에 미치는 영향을 확인해 보았다. 그 결과로 흰다리새우 사료에 면역유도된 갯지렁이 분말을 첨가하면 대조군에 비해 WG와 SGR을 향상시킬 수 있다는 것이 확인되었다. 뿐만 아니라 갯지렁이 분말 첨가 농도가 높아질수록 FCR과 PER이 더 개선되는 결과가 확인되었다. 이전 연구에서도 틸라피아, 잉어 등의 사료에 항균펩타이드를 첨가했을 경우 final weight, DG, SGR이 개선되었다고 보고하였다(Jiang et al., 2011; Lin et al., 2014; Dong et al., 2015). 또한 잉어에서 apidaecin을 첨가한 사료를 급이하면 성장성 개선과 FCR 감소의 효과가 나타났다고 보고하였다(Zhou et al., 2008). 이러한 연구들은 항균펩타이드를 사료첨가제로 사용하면 양식어의 성장성에 좋은 영향을 미칠 수 있다는 것을 시사하며 성장성의 개선의 이유는 상재미생물총(indigenous microbial flora)의 생태학적 균형과 관련이 있다고 보고하였다(Dong et al., 2015).

흰다리새우에 대한 면역유도 갯지렁이 분말이 혈청 성분에 미치는 영향을 확인하기 위하여 실험사육 기간 동안 흰다리새우의 혈청성분을 조사하였다. 혈청 성분은 생리학적, 면역학적 상태를 객관적이고 효과적으로 나타내는 민감한 지표이다(Hawkins and Mawdesley-Thomas, 1972; Hrubec et al., 2000). 이번 연구에서는 AST, ALT, GLU, TCHO, 라이소자임 활성 및 코르티졸을 분석하였다. 일반적으로 AST와 ALT는 간세포 손상으로 인해 혈액으로 방출되기 때문에 간 손상을 평가하는 지표로 널리 사용된다(Lemaire et al. 1991). 본 연구를 통해 얻은 흰다리새우 혈청의 AST와 ALT 수치는 대조군에 비해 유의한 차이를 보이지 않았다(p > 0.05). 따라서 면역유도 갯지렁이 분말은 흰다리새우의 간 기능에 영향을 미치지 않을 것으로 예상된다. TCHO의 농도는 불규칙한 지방 대사, 포도당 대사 및 간의 내분비계의 지표로 사용된다(Lemaire et al. 1991). 이번 연구에서 새우 혈청에서 얻은 TCHO 농도는 대조군과 유의한 차이를 보이지 않았다(p > 0.05). 이전 연구에서 600 mg/kg 농도의 cecropin을 첨가한 사료를 급이한 잉어는 대조군보다 TCHO 수치가 현저히 낮게 나타났고(Dong et al., 2015), antimicrobial lipopeptides를 첨가한 사료를 급이한 돼지에서도 감소했다(Du et al., 2011). 이는 혈청 성분 수치에 대한 항균펩타이드의 효과가 동물 종 및 항균펩타이드 유형에 따라 다를 수 있음을 나타낸다. GLU는 혈청 코르티졸과 함께 어류의 스트레스 지표로도 사용되며, GLU 수치가 높을수록 어류의 스트레스가 높다는 것을 나타낸다(Lemaire et al. 1991; Eslamloo et al., 2012). 스트레스는 양식에서 호르몬 분비, 대사, 면역 및 영양소 이용에 영향을 줄 수 있는 중요한 요소다(Hossain et al., 2016a; Hossain et al., 2016b). 이번 연구에서 GLU 수준은 대조군과 유의한 차이는 없었지만(p > 0.05) 대조군과 모든 실험군에서 GLU 수치가 높게 나타났는데, 공식 방지를 위해 하루 5회 사료를 급이하였기 때문에 혈당 수치가 전체적으로 증가했을 가능성이 있다.

라이소자임은 숙주 선천 면역의 중요한 구성 요소이며(Ellis, 1990) 혈중에 존재하는 점액분해효소로써 숙주에서 세균 감염에 대한 방어에 중요한 역할을 한다(Saurabh and Sahoo, 2008; Vallejos-Vidal et al., 2016). 이번 연구에서 라이소자임 활성은 0.05% 실험군이 전체 기간에 걸쳐 대조군과 유사한 값을 나타내었으며 0.1%, 0.5%, 1% 실험군에서는 꾸준히 증가하였고, 특히 1%실험군은 대조군과 비교하여 유의한 증가가 관찰되었다(p < 0.05). 이와 유사하게 틸라피아, 잉어 등에 항균펩타이드가 보충된 사료를 급이하였을 때 혈청 라이소자임 수치가 증가했다고 보고되었다(Zhou et al., 2008; Lin et al., 2014; Zahran et al., 2019). 혈중 코르티졸 수치는 시상하부-뇌하수체-부신축의 활성에 의한 직접적인 스트레스 지표로 사용된다(Pottinger and Carrick 1999). 어류의 코르티졸 수치는 정상 조건에서 5ng/mL 미만이며 자극에 노출되면 100배 이상 증가할 수 있다(Pickering and Pottinger, 1989; Barton and Iwama, 1991). 이번 연구에서 얻은 흰다리새우의 혈청 코르티졸 농도는 5 ng/mL 미만이므로 실험에 사용된 사료는 흰다리새우에 스트레스를 주지 않을 것으로 예상된다.

총 8주간의 실험사육 후 V. harveyi에 감염된 흰다리새우는 6일차에 1% 실험군에서 대조군과 비교하여 유의적으로 높은 폐사율이 발생하였고 0.5%와 1% 실험군의 폐사율은 대부분의 기간에서 대조군에 비해 유의적이지는 않지만 높은 폐사율을 나타내었다. 이는 라이소자임 활성 수치를 참고하였을 때 새우에 대한 고농도의 갯지렁이 분말 첨가사료는 오히려 면역능에 과부하를 줄 가능성이 있다고 생각된다. 이에 반해, 10일차까지 0.05% 실험군의 폐사율은 대조군과 다른 실험군에 비해 낮게 나타났고 최종누적폐사율 또한 가장 낮게 나타났기에 명확한 효능 검증을 위해 0.05% 첨가 사료를 이용하여 양식장 규모의 실험이 추가적으로 필요할 것으로 생각된다.

Ⅴ. 결 론

결론적으로 항균펩타이드 유도 갯지렁이 분말을 사료에 첨가하면 흰다리새우의 혈청 성분 등의 안전성에 영향을 미치지 않으면서 성장성에 좋은 결과를 나타낼 수 있으며, 특히 0.05%의 분말을 첨가하면 세균 감염(V. harveyi)에 대해 어느 정도 내성을 보일 가능성이 있다. 이번 연구는 소규모 연구이기 때문에 이러한 결과를 토대로 흰다리새우 양식장 규모로 검증이 필요할 것으로 생각된다.

Acknowledgments

This work was supported by the ‘Smart Aquaculture Research Center’, funded by the Ministry of Oceans and Fisheries, Korea.

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