Current Issue

인공수정을 위한 채란·채정용 어미는 통영 자란만(34°51′32.34″ N, 128°12′23.44″ E)에서 양성중인 참굴 모패를 사용하였다(<Table 1>). 참굴의 알은 난핵포붕괴 이전에도 수정이 가능하므로, 성숙한 암수 생식소 부위를 절개하여 암수 5:1의 비율로 각각 알과 정자를 채란·채정한 후, 미리 준비해 둔 여과해수(23℃)에 넣어 수정하여 세란하였다.

발생수온은 23℃(±0.3)를 유지하였으며, 20 L 수조(n=3)에 수용한 다음, 수정란, 포배기, 낭배기, 트로코포아 및 D형유생에 도달하는 시간을 조사하였다. 각 발생단계에 따라 Motic Image Plus 2.0(Motic Instruments Inc, China)을 이용하여 0.1 µm까지 측정하였다. 수정여부는 제 1 극체가 방출된 알로 판단하였으며, 발생단계의 구분은 각 단계에서 80% 이상의 발달이 진행되었을 때로 하였고, 3개의 수조에서 각 단계별 500 µL(미수정란; 약 700±10, 수정란; 750±5, 포배기; 650±10, 낭배기; 650±10, 트로코포아; 550±10, D형유생; 450±5개체)씩 채취하였다.

참굴의 각 발생단계에 따른 IGF-I의 발현을 확인하기 위해 immunoblot assay를 실시하였다.

발생단계별 500 µL씩(평균 625±8개체) RIPA buffer(50 mM Tris, 1 mM EGTA, 150 mM Nacl, 1% NP-40, 0.25% Na-deoxycholate) 1 mL에 넣고 균질화한 다음, 12000 rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액을 분리하였다. 단백질 농도는 BCA protein assay kit(Thermo, #23225)를 사용하여 microplate reader(EZ Read 400, Biochrom, UK)에서 562 nm로 측정하였다. 50 µg의 단백질을 8-15% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)로 분리하고, polyvinylidene fluoride(PVDF) membrane으로 옮겼다. PVDF membrane은 tris buffered saline with Tween-20(TBST)에 용해된 10% bovine serum albumin(BSA)에서 1시간동안 실온에서 반응시켰다. 1차 항체는 IGF-I, IGF-IR, tyrosine-phosphorylation(P-Tyr)과 β-actin을 1:1000의 비율로 희석하여 사용하였으며, 실험에 사용한 항체는 모두 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA, USA)을 사용하였다. 2차 항체는 Goat anti-mouse IgG, (H+L) horceradish peroxidase conjugated(Thermo, #31430)를 1:10,000의 비율로 희석하여 사용하였다. Densitometry는 Gene Tools version 4.03(SYNGENE, Cambridge, UK)을 이용하여 확인하였다.

Total RNA 추출은 Trans Zol UP(TransGen Biotech, Beijing, China)을 이용하여 분리하였고, cDNA 합성은 total RNA를 주형으로 Prime Script First cDNA Synthesis Kit(TaKaRa Bio, Shiga, Japan)을 사용하여 합성하였다.

각 유전자들의 발현은 real time qPCR을 사용하여 정량분석하였다. 분석은 TB Green Premix ExTaq II(TaKaRa Bio, Shiga, Japen)를 사용하였으며, Thermal Cycler Dice Real Time System을 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR에 사용된 primer는 Moon and Choi(2019)에 따라 <Table 1>에 나타내었다. PCR증폭은 95℃ 30초, 60℃ 30초 및 72℃ 30초로 총 30회 수행되도록 하였으며, 최초 변성 반응은 95℃ 5분을 실시하였다. 또한 각 cDNA별로 3회 반복 증폭 시험을 실시하였다. 각 유전자의 발현은 EF1α(Elongation factor 1 alpha)의 상대정량을 통해 분석하였다.

실험의 분석결과는 SPSS 프로그램(Statistical Package for Social Science, SPSS Inc, Chicago, IL, USA)을 이용하여 처리하였고, one-way ANOVA test를 실시하여 Duncan’s multiple range test(Duncan, 1955)로 유의성을 검증하였다.

본 연구에서 발생수온은 Chang et al.(2000)에 의한 연구결과에서 제시된 적정수온인 20~25℃의 평균값인 23℃(±0.3)로 설정하였다. 참굴의 수정란은 60.1±3.2 µm, 포배기 56.3±3.5 µm, 낭배기 49.8±3.3 µm, 트로코포아 54.0±11.2 µm 및 D형 유생은 각장 46.5±2.6 µm, 각고 50.9±10.5 µm였다([Fig 1]). 수온 23℃(±0.3)에서, 각각의 발생 소요시간은 수정란에서 포배기에 이르기까지 6시간 30분, 낭배기에는 14시간 35분, 트로코포아까지 22시간 30분, D형 유생까지는 28시간이 소요되는 것으로 나타났다. 본 연구 보다 낮은 수온인 21℃(±1.0)에서 참굴을 발생시킨 Hur and Hur(2000)의 연구결과에서는 수정란에서 포배기에 이르는 시간이 5시간, 낭배기에 이르는 시간이 7시간, 트로코포아에 이르는 시간이 10시간, D형유생까지 23시간 55분으로 나타났다. 또한, 참굴을 20℃와 25℃에서 각각 배발생시킨 Chang et al.(2000)의 연구결과에서는 수정란에서 트로코포아에 이르는 시간이 각각 12시간 50분과 9시간 13분, D형유생까지는 26시간 17분과 17시간 35분으로 나타났다. 본 연구와 비슷한 수온인 23~24℃의 수온에서 발생시킨 Li et al.(2019)의 연구결과에서는 트로코포아에 이르는 시간이 12시간, D형유생까지 24시간으로 나타났다. 본 연구에서 사용된 사육수의 수온이 20℃(Hur and Hur, 2000)와 21℃(Chang et al., 2000)보다 높은 23℃(±0.3)이고, 23~24℃(Li et al., 2019)와는 비슷한 수온임에도 불구하고 발생시간이 많이 소요되었다. 이러한 이유는 유생이 발달하는 시기에 먹이공급의 부재와 난질에 따른 결과로 사료된다. 난질은 먹이 섭취 전 유생 단계뿐만 아니라 그 이후 발생 단계에 성장과 생존에도 영향을 미치기 때문이다(Wilson et al., 1996; Duan, 1997).

[Fig. 1] 
Developmental stages in Pacific oyster (Crassostrea gigas). Developmental stages: (a) Unfertilized egg, (b) Fertilized egg, (c) Blastula., (d) Gastrula, (e) Trochophore, (f) D-shaped larva. Scale bar=20 µm.

IGF 시스템은 리간드(ligand), IGF 수용체인 IGF-IR, IGF-결합단백질인 IGFBPs로 구성되어있으며(Duan, 1997), IGF-I는 세포분열촉진제로서 여러 형태의 세포에 걸쳐 세포증식을 자극하고, 세포의 분화와 세포기능의 발현에 관여한다(Maures et al., 2002). 본 연구에서, 참굴의 미수정란부터 D형유생까지 IGF-I 발현을 확인하기 위해 western blot으로 분석한 결과, 미수정란보다 수정란에서 유의하게 높은 값을 확인할 수 있었으며(P<0.05), 포배단계에서 가장 높은 값을 보인 후 다시 감소하였다([Fig. 2. a]).

[Fig. 2] 
Changes in protein expression during development in Pacific oyster(Crassostrea gigas). Western blot of (a) IGF-I, (b) IGF-I receptor and (c) Tyrosine-phosphorylation(PY99). UE, unfertilized egg; FE, fertilized egg; B, blastula; G, gastrula; T, trochophore; D, D-shaped larva. *P<0.05 compared with unfertilized egg(n=3).

이러한 결과는 starry flounder, Platichthys stellatus의 배발생에서도 동일하게 보고되었는데, 포배기까지 IGF-I의 발현이 높은 수준으로 유지된 후 다시 감소하였다(Xu et al., 2015). 한편, 본 연구결과 IGF-IR의 발현도 IGF-I의 발현과 유사한 경향을 보였으며([Fig. 2. a, b]), real time qPCR을 통한 MIP, IGFBP-ALS, IGF-IR mRNA의 발현도 IGF-I 발현과 비슷한 경향을 보였다([Fig. 3. a, b]). MIP mRNA 수준이 수정란에서는 수정 전 수컷 생식소와 암컷 생식소의 중간 정도의 발현값을 나타내었다. 이는 gilthead seabream, Sparus aurata(Perrot et al., 1999)과 zebrafish, D. rerio(Schlueter et al., 2007)에서 수정란의 IGF-I mRNA가 수정 전 암컷 생식소와 수컷 생식소로부터 유전되었다는 연구결과와 유사하였다. 또한 gilthead seabream, S. aurata에서도 mRNA수준에서 IGF-I과 IGF-IR의 발현이 동일하게 나타나며 발육초기에 IGF-I이 성장 촉진 역할을 하는 것으로 보고된 바 있다(Perrot et al., 1999). Starry flounder, P. stellatus의 배발생에서 IGF-I mRNA 수준은 포배기까지 높게 유지하다가 낭배기에서 유의하게 감소하였다(Xu et al., 2015). 본 연구에서도 포배기에서 높은 수준으로 나타나는 것을 볼 수 있었으며, 운동성이 나타나는 트로코포아단계에서 유의하게 높은 값을 보였다. IGF-IR의 결합에 의한 자가인산화 반응은 배발생을 촉진시키며(Duan and Xu, 2005), IGF-IR의 인산화는 하위시그널의 연속적인 반응을 야기한다(Jones and Clemmons, 1995). 본 연구 결과에서 IGF-IR의 활성화를 확인하기 위해 phospho-tyrosine의 발현을 조사한 결과, 발생이 이루어지는 수정란부터 D형유생까지 관찰할 수 있었으며, 수정란과 포배기에서 유의하게 높은 값을 보였다(P<0.05)([Fig. 2. c]). IGF-I의 신호전달이 zebrafish, D. rerio의 배발생동안 정상적인 발달에 결정적인 역할을 하는 것으로 보고되고 있다(Zou et al., 2009). 본 연구결과, 포배기에서 IGF-I의 높은 발현은 수정란에서 포배기로 세포분열이 활발하게 일어나는 시기에 IGF-I이 세포분화에 작용하기 때문이다(Pozios et al., 2001). 본 연구에서 참굴의 발생이 진행되어 유생단계에 이르렀을 때 IGF-I과 IGF-IR의 발현이 감소하였는데, 이는 발생소요시간 지연과 관련된 난질의 영향과 유생단계부터 공급되는 영양 상태에 의한 것으로 보인다. IGF-I의 발현 양상은 영양 상태와 관련이 있으며(Duan, 1998), 환경의 변화에 따라 달라질 수 있기 때문이다(Wilson et al., 1996; Duan, 1997).

[Fig. 3] 
Expression of molluscan insulin –related peptide 3-like(MIP), insulin-like growth factor-binding protein complex acid labile submit (IGFBP-ALS) and Crassostrea gigas insulin-related peptide receptor(CIR) mRNA in Pacific oyster(Crassostrea gigas). The mRNA expression of elongation factor 1 alpha(EF1α). MG, male gonad; FG, female gonad; FE, fertilized egg; B, blastula; G, gastrula; T, trochophore; D, D-shaped larva. *P<0.05(n=3).