The Korean Society Fishries And Sciences Education

Current Issue

The Journal of the Korean Society for Fisheries and Marine Sciences Education - Vol. 32 , No. 3

[ Article ]
The Journal of the Korean Society for Fisheries and Marine Sciences Education - Vol. 32, No. 3, pp.694-700
Abbreviation: J Kor Soc Fish Mar Edu.
ISSN: 1229-8999 (Print) 2288-2049 (Online)
Print publication date 30 Jun 2020
Received 25 Mar 2020 Revised 13 Apr 2020 Accepted 28 Apr 2020
DOI: https://doi.org/10.13000/JFMSE.2020.6.32.3.694

Florfenicol 경구 투여에 따른 조피볼락 혈액의 약동학적 특성
서정수 ; 정승희
국립수산과학원(연구사)
국립수산과학원(연구관)

Pharmacokinetics of Florfenicol in Blood of the Culture Korean Rockfish Following Single Oral Administration
Jung-Soo SEO ; Sung-Hee JUNG
National Institute of Fisheries Science (researcher)
National Institute of Fisheries Science (senior researcher)
Correspondence to : 055-640-4771, jsseosoo@korea.kr

Funding Information ▼

Abstract

The pharmacokinetics characterization of florfenicol(FF) after single oral medication was studied in the cultured korean rockfish, Sebastes schlegelii, using high performance liquid chromatography(HPLC). After single oral medication of FF(20 ㎎/㎏ body weight) in the cultured Korean rockfish(590±50 g, 23±1.5℃), the FF concentration in the serum was determined at different period(1, 5, 10, 15, 24, 30, 50 and 168 h post dose). The pharmacokinetics profile of FF oral medication in serum were analyzed to a one- or two-compartment model by WinNonlin program, respectively. Under the one-compartment model, the area under the concentration-time curve(AUC), maximum concentration(Cmax) and time for maximum concentration(Tmax) were 31.84 ㎍·h/㎖, 1.14 ㎍/㎖, and 9.3 h, respectively. Under the two-compartment model, the AUC, Cmax and Tmax were 45.52 ㎍·h/㎖, 1.14 ㎍/㎖ and 9.43 h, respectively. The results of this study could be used for determining efficacy dosage and withdrawal times of FF for the therapy of bacterial diseases in korean rockfish.


Keywords: Florfenicol, HPLC, Pharmacokinetics, Oral, Korean rockfish

Ⅰ. 서 론

Florfenicol(FF)은 2001년부터 수산용 동물용의약품으로 품목허가 받아 국내에 판매되었으며, 그람 양성균(gram positive bacteria) 및 음성균(gram negative bacteria)에 대하여 폭 넓은 항균 스펙트럼을 나타내는 클로람페니콜(chloramphenicol) 계열의 합성항균제이다(NIFS, 2018). FF는 방어, 송어의 유결절증 및 연쇄구균증, 뱀장어의 에드와드병 등 세균성 질병을 치료하기 위하여, 어류 무게 1 ㎏ 당 10 ㎎(역가)의 양이 되도록 사료에 첨가하여 5일 연속으로 경구 투여하도록 74개 제품이 허가 되어 있다. FF는 여러 동물 등에서 사용되고 있으므로, 국내의 식품의 기준 및 규격에서는 FF의 잔류허용기준 수치를 수생동물인 어류에서는 0.2 ppm 및 갑각류에서는 0.1 ppm으로 설정하고 있다(KFDA, 2019). 잔류허용기준 수치에 따라 양식 품종인 뱀장어, 농어의 휴약 기간은 7일, 송어, 은어, 연어는 14일, 방어는 5일로 설정되어 있다.

국내와 유사한 양식 품종을 키우는 일본에서 FF는 국내와 동일한 양식 어류의 세균성 질병 치료제로 판매되며, 용법·용량, 휴약 기간 등이 국내와 동일하다(MAFF, 2015). 미국(FDA)에서는 연어과 어류와 메기의 세균성 질병 치료 목적으로 경구 투여(역가 10 ㎎, 10일 연속투여) 방법으로 휴약 기간은 12일로 승인 판매되고(AFS, 2011), 캐나다에서는 절창병 혹은 에로모나스병(Aeromonas salmonicida)으로 알려진 연어의 질병 치료를 위해 수산용의약품으로 판매되고 있다(Health Canada, 2012).

국내에서는 집약적 고밀도 사육, 사육환경의 악화 등 환경변화 등에 따라 다양한 질병이 발생되고 있다(Seo et al., 2018). 어류의 세균성 질병 치료 효능을 얻기 위해서는 약물의 다양한 투여방법에 따른 혈중농도(Cmax), 소실반감기(CL or T1/2) 등 생체 내 약동학적(pharmacokinetics parameter) 기초 자료가 필수이다. 이러한 기초 데이타를 바탕으로 안전하고 유효한 의약품 개발을 수행할 수 있으며, 현재까지 FF의 어류에 대한 약동학적 연구는 해산 어류에서 대서양 연어(Horsberg et al., 1996; Martinsen et al., 1993), 대서양 대구(Samuelsen et al., 2003), 넙치(Jung and Seo, 2013; Lim et al., 2011), 가자미(Chang et al., 2019) 등에서 연구되었으며, 담수 어류로는 잉어(Yanong and Curtis, 2005; Zhao et al., 2011), 메기(Park et al., 2006), 틸라피아(Feng et al., 2008; Feng and Jia, 2009)등에서 다수 연구되었다.

FF의 수산용의약품으로서의 국내 판매량(역가 기준)은 2010년 2,452 ㎏에서 2018년 6,609 kg으로 사용량이 계속 증가하였다. FF의 국내 판매량으로 보았을 때 품목 허가 대상 외에 국내 주요 양식 품종인 조피볼락 등에서도 사용이 가능하다고 보아지며, 이는 법적으로 양식 현장에서 수산질병관리사 등이 약사법에 의거하여 조피볼락에 FF를 진료・처방할 수 있다. 그러나, 조피볼락의 세균성 질병 치료를 위하여 FF의 진료・처방을 위한 용법, 용량 및 휴약 기간과 관련된 연구 자료는 없다. 특히, 국내・외에서 어류를 대상으로 다양한 투여방법에 따른 약동학적 특성 연구가 이루어져 있으나, 국내 두 번째로 양식 생산량이 많은 조피볼락(Korean rockfish)에 대한 FF의 약동학적 특성 연구는 없다. 따라서, 본 연구에서는 FF를 조피볼락에 1회 경구 투여하였을 때 혈액에서의 약동학적 기초 자료를 얻고자 수행하였다.


Ⅱ. 재료 및 방법
1. 시약 및 시험어류

본 시험에 사용된 표준품인 florfenicol(FF)은 Sigma사(USA)를 사용하였고, 기타 HPLC 분석용 시약들은 Merck사의 제품을 사용하였다. 본 실험에 사용한 조피볼락은 이전에 항생제를 사용하지 않은 건강한 조피볼락(Sebastes schlegelii, 590±50 g)을 사용하였으며, 사육 수온은 아쿠아트론을 이용하여 23±1.5 ℃로 일정하게 유지하며 유수식으로 관리하였다. 총 4개의 수조에 5마리 씩 나누어서 관리하였으며 총 20마리를 사용하였다. 실험어류는 약제 투여 하루 전부터 절식하였다.

2. 약제 투여 및 시료 채취

조피볼락 혈액에서 FF의 약동학적 특성을 조사하기 위하여, 사용 대상 어종의 권장 투여량(10 ㎎/㎏)의 2배에 해당하는 양(20 ㎎/㎏)을 선택하여 실험을 수행하였다. 실험 어류는 약제 투여 하루 전부터 절식하였으며, 어체 중 ㎏ 당 20 ㎎이 되도록 Jung and Seo(2013)의 방법에 따라서 약제 사료를 만들어 강제로 경구 투여하였다. 간단히 설명하면, 경구 투여는 20 마리를 대상으로 1회 실시하였으며 5마리씩 4개의 수조에 나누어서 수용하였다. 투여가 종료된 직후(0 시간)부터 1, 5, 10, 15, 24, 30, 50 및 168 시간마다 5마리로부터 혈액을 채취하였으며, 각 수조에서 1 및 24 시간, 5 및 30 시간, 10 및 50 시간 그리고 15 및 168 시간별로 반복해서 어류로부터 채혈하였다. 실험 어류는 마취 없이 미부혈관으로부터 한 마리 당 혈액 약 1 ㎖를 주사기로 채취, 상법에 따라서 혈청을 분리 후 -80 ℃에 보관하였다가 HPLC 분석에 이용하였다. 더불어, 실험기간 동안 실험 어류에서 총 2회의 반복채혈을 실시하였으나 폐사한 실험 어류는 없었다.

3. HPLC 분석 및 전처리 방법

분석기기는 HPLC(Agilent, 1200)을 사용하였으며 기기분석 조건은 <Table 1>에 나타내었다. 간단히 설명하면, 이동상은 acetonitrile과 증류수(D.W.)를 35:65(v/v)의 비율로 주입하였으며, 검출파장은 226 nm, 칼럼(column) 온도는 상온의 조건으로 실시하였다. 조피볼락 혈액에 잔류하는 FF의 전 처리는 [Fig. 1]에서 보는 바와 같다. 간단히 설명하면, 분리된 혈청(serum)의 전 처리는 혈청 200 ㎕에 같은 양(200 ㎕)의 acetonitrile을 넣어 균질화한 다음, 상온에서 10분간 정치하고 원심분리(10,000 rpm, 20 min)를 수행하였다. 얻어진 상등액을 주사기 필터(0.45 ㎛)로 여과해서 HPLC로 분석하였다.

<Table 1> 
HPLC used for the analysis of florfenicol
Instrument Agilent HP1200 system
Column COSMOSIL, 4.6×150 ㎜
(C18, 5㎛)
Mobile phase Acetonitrile-Water
(35 : 65, V/V)
Flow rate 1 ㎖/min
Injection vol. 20 ㎕
Oven temp. Room temperature
UV Detector Ultraviolet λ=226 nm
Analysis time 15 min


[Fig. 1] 
Extraction process of florfenicol from the serum of Korean rockfish.

4. 표준검량선 및 회수율 측정

FF의 표준곡선 및 회수율 측정은 이전의 논문(Jung and Seo, 2013)에 따라 진행하였으며, 표준용액은 다양한 농도(0.19, 0.39, 0.78, 1.56, 3.12, 6.25, 12.5, 25, 50 ppm)로 이동상에 녹인 표준용액을 HPLC에 20 ㎕ 주입하여 도출된 피크면적에 의하여 표준곡선을 작성하였다. 회수율을 구하기 위해 FF 표준 용액을 0.1, 1 및 10 ppm 농도가 되게 조피볼락 혈청에 첨가한 후, 각 농도 샘플에서 FF를 추출하여 HPLC를 이용하여 분석하였다.

5. 약동학적 해석

조피볼락에 대한 FF의 경시적 혈중농도는 WinNonlin 프로그램(Pharsight Co., Inc., USA)을 이용하여 One- 및 Two-compartment model로 약동학적 변수(pharmacokinetics parameter)를 조사하였다.


Ⅲ. 결과 및 고찰
1. 표준검량선 및 회수율

FF의 표준 검량선을 분석한 결과, 농도에 따라 잔류량(peak)의 넓이가 비례하여 유의미한 직선성의 검량선이 작성되었으며 이 결과는 이전의 Jung and Seo(2013)와 유사하게 나타났다. 조피볼락에 대한 회수율을 조사한 결과 0.1, 1.0, 10 ppm에 대하여 각각 73.07±2.59, 92.11±2.04, 79.78±1.18 %로 나타났다. 이 결과는 넙치를 대상으로 회수율 조사를 한 89.21±1.18∼95.01±2.04%보다는 낮게 나타남을 알 수 있었다(Jung and Seo, 2013). HPLC를 이용하여 어류 혈액의 FF 회수율을 조사한 논문에 따르면, 무지개송어(rainbow trout), 배스(striped bass hybrid), 채널메기(channel catfish), 철갑상어(lake sturgeon) 및 호수송어(lake trout)의 혈액에서의 FF 회수율이 평균 84.1∼104.0%(Vue et al., 2002)로 보고되며, 메기(korean catfish)는 89.6∼99.8%(Park et al., 2006), 붕어(crucian carp)는 91.25∼98.37%(Zhao et al., 2011)로 나타났다. 본 논문에서 조피볼락 혈액의 FF 회수율은 평균 73.07∼92.11%로 나타났는데, 이전 연구자들의 회수율과 비교 시 유사한 경향을 나타내었다. 본 연구의 분석방법 검출 한계는 0.05 ppm으로 나타났으며 국내 식품공전에서 규정하는 어류 및 갑각류에 대한 FF의 검출한계 0.05 ppm에서 크게 벗어나지 않았다.

2. 경시적 농도 변화

20 ㎎/㎏ 농도로 FF를 조피볼락에 경구 투여한 후 혈청에서의 경시적 농도 변화는 [Fig. 2]에 나타내었다. 경구 투여 후 10시간째 1.11 ㎍/㎖로 최대값을 보였으며, 24시간째는 약 절반의 값인 0.7 ㎍/㎖로 감소하였다. 이후 완만한 소실작용을 보이다가 264시간째는 0.07 ㎍/㎖이었다.


[Fig. 2] 
Concentration (㎍/㎖) of florfenicol in serum of Korean rockfish after single oral medication of 20 ㎎/kg b.w., at 23±1.5℃.

3. 약동학적 검토

조피볼락의 FF 경구투여에 따른 약동학적 매개변수의 값은 <Table 2>에 나타내었다.

<Table 2> 
Pharmacokinetics factors for florfenicol in serum of Korean rockfish following oral medication with 20 ㎎/㎏ b.w., at 23±1.5℃
Parameters
(unit)
1-compartment 2-compartment
AUC (㎍·h/㎖) 31.84 45.52
K10(1/h) 0.066 0.0001
K12(1/h) - 0.09
K21(1/h) - 0.002
α (1/h) - 0.09
β (1/h) - 0.00
T1/2α(h) - 7.46
T1/2β(h) - 241214
A (㎍/㎖) 3.53 9.98
B (㎍/㎖) - 0.07
Tmax(h) 9.30 9.43
Cmax(㎍/㎖) 1.14 1.14
Abbreviations: AUC, area under the concentration-time curve; KXX, the elimination rate constants from various compartments; α, β, rate constant of slop; T1/2α, distribution half-life of the drug; T1/2β, elimination half-life of the drug; A, B, zero time drug concentration intercepts for the first and second phases; Tmax, time for maximum concentration; Cmax, maximum concentration.

One-compartment로 분석 시 혈중 농도-시간곡선 면적(AUC)은 31.84 ㎍·h/㎖, 최고농도 도달 시간(Tmax)은 9.299 h, 혈중 최고농도(Cmax)는 1.14 ㎍/㎖로 계산되었으나, Two-compartment로 분석 시 혈중농도-시간곡선 면적(AUC)은 45.52 ㎍·h/㎖, 최고 농도에 도달 시간(Tmax)은 9.43 h, 최고농도(Cmax)는 1.14 ㎍/㎖로 계산되었다.

어류에 대한 약동학적 연구는 약물 투여량, 공복시간, 약물의 생체 대사 및 약물 배설율 등 같은 여러 인자(factor)에 의존하며(Treves-Brown, 2000), 특히, 사육 수온에 따라 영향을 많이 받으며 잔류기간도 저수온에 비해 고수온에서 현저히 짧아진다고 알려져 있다(Björklund and Bylund, 1990; Zhang and Li, 2007). 국내・외 많은 연구자들이 어류를 대상으로 경구 투여 시 FF의 약동학적 인자 혹은 매개변수 가운데 혈중 농도-시간곡선 면적(AUC), 혈중 최고농도 도달 시간(Tmax), 혈중 최고농도(Cmax) 항목을 본 연구의 Two-compartment model로 얻어진 수치와 비교한 결과를 <Table 3>에 나타내었다.

<Table 3> 
Comparative pharmacokinetics factors for florfenicol following oral medication in several fish species
Parameters
(unit)
Koi
carpa
Korean
catfishb
Crucian
carpe
Atlantic
salmond
Atlantic
salmone
Codf Olive
flounderg
Spotted
halibuth
Korean
rockfishi
Dose (㎎/㎏) 50 20 5 10 10 10 20 30 20
Weight (g) 144±44 280.4±20.8 260±30 194±40 460±87 100∼200 700±50 615±10.5 590±50
Water tem. (℃) 23∼25 23.5±1.7 25±1 10.8±1.5 10±0.3 8±0.5 23±1.5 20±0.5 23±1.5
AUC (㎍·h/㎖) 262.6 246.61±14.66 276.12 112 139.9 524 22.51 286.86 45.52
Tmax (h) 3.0 8.0 1.61 10.3 6 7 8.62 12 9.43
Cmax (㎍/㎖) 12.3 9.59±0.36 29.32 4.0 9.1 10.8 0.84 12.2 1.14

일반적으로 약동학적 매개변수는 동일 어종, 투여 방법, 사육수온, 약동학적 분석방법 등에 따라 차이가 나타난다.

동일 어종(대서양 연어)에서 투여량 및 사육수온이 같을 경우 FF를 경구 투여할 시에 크기가 큰 어류가 작은 어류보다 혈중의 FF 농도가 빠르게 고농도로 흡수되는 것으로 보아졌다(Horsberg et al., 1996; Martinsen et al., 1993). 더불어, 동일 어종(koi carp)이지만 투여량 및 투여방법에 따라서도 FF의 경우 근육투여가 경구투여보다 Cmax수치가 1.5배의 높은 농도를 나타내었으며(Yanong and Curtis, 2005), 어류를 대상으로 FF를 투여 시 근육투여가 경구투여보다 Cmax수치가 높게 나타남을 알 수 있다(Park et al., 2006; Zhao et al., 2011)

본 연구에서는 증명하지 못하였으나, 향후 조피볼락에 대한 FF의 투여 회수, 투여방법별 및 사육 수온별로 다양한 약동학적 연구가 더 심도 있게 진행되어야 하겠다.

어류 질병을 치료하기 위하여 항생제인 FF를 투여 시 치료 효능을 높이기 위해서는 조직 내 분포하는 약물농도와 지속기간이 중요하다. 본 연구 결과에서 허가받은 용량보다 2배 많은 용량으로 조피볼락에 경구 투여 시 혈중 농도가 1.2 ppm으로 나타났다. 이전 논문(Jung and Seo, 2013)에 의하면 국내 조피볼락에서 분리된 병원체 세균인 Photobacterium damselae subsp. damselaeLactococcus garivae의 Minimum inhibitory concentration(MIC)가 각각 3.13 및 1.56 ppm으로 보고되었다. 어류의 혈중농도와 약물의 치료효능이 직접적인 상관관계를 나타내는 것은 아니나, 이전 논문(Shojaee and Lees, 2000)의 논문에 따르면 의약품은 MIC의 1배~2배 이상의 농도로 혈중 내에서 일정기간 동안 유지하여야 치료 효능이 있다고 알려져 있다. 따라서, 향후 추가 연구를 통해 1회 투여가 아닌 5일 연속 및 허가 용량의 2배 이상의 투여 시 조피볼락 혈중 및 근육에서의 잔류량을 측정하여 FF의 안전하고 유효한 용법ㆍ용량 및 휴약 기간 등을 확보하여야 할 것으로 보아지며, 이를 통해서 실제 양식장에서 조피볼락 현장 적용을 위한 용법・용량 등 가이드라인을 명확히 제시할 수 있으리라 본다.


Acknowledgments

이 논문은 국립수산과학원(RP-2020004) 지원에 의해 수행되었습니다.


References
1. AFS(American fisheries society)(2011). Guide to using drugs, biologics, and other chemical in aquaculture, FCS working group on aquaculture drugs, chemicals, and biological, 20~48.
2. Björklund H and Bylund G(1990). Temperature-related absorption and excretion of oxytetracycline in rainbow trout(Salmo gairdneri R.). Aquaculture, 84, 363~372.
3. Chang Z, Chen A, Gao H, Zhai Q and Li J(2019). Pharmacokinetic profiles of florfenicol in spotted halibut, Verasper variegatus, at two water temperatures. Journal of Veterinary and Pharmacology and Therapeutics, 42(1), 121~125.
4. Feng JB and Jia XP(2009). Single dose pharmacokinetic study of florfenicol in tilapia (Oreochromis niloticus × O. aureus) held in freshwater at 22℃. Aquaculture, 289, 129~133.
5. Feng JB, Jia XP and Li LD(2008). Tissue distribution and elimination of florfenicol in tilapia(Oreochromis niloticus × O. aureus) after a single oral administration in freshwater and seawater at 28℃. Aquaculture, 276, 29~35.
6. Health Canada(2012). http://www.hc-sc.gc.ca/dhp-mps/vet/legislation/pol/aquaculture-eng.php.
7. Horsberg TE, Hoff KA and Nordmo R(1996). Pharmacokinetics of florfenicol and its metabolite florfenicol amine in Atlantic salmon. Journal of Aquatic Animal Health, 8, 292~301.
8. Jung SH and Seo JS(2013). Antimicrobial activity of florfenicol against fish pathogenic bacteria and pharmacokinetics in blood of cultured olive flounder by oral administration. JFMSE, 25(5), 1079~1087.
9. KFDA(Korea Food & Drug Administration)(2019). MRLs for veterinary drugs in foods. 1~729.
10. Lim JH, Kim MS, Hwang YH, Song IB, Park BK and Yun HI(2011). Pharmacokinetics of florfenicol following intramuscular and intravenous administration in olive flounder (Paralichthys olivaceus). Journal of Veterinary Pharmacology and Therapeutics, 34, 206~208.
11. MAFF(Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries)(2015). Manual of fish drug to aquaculture farmer, Food Safety and Consumer Affairs Bureau, Animal Products Safety Division, 28, 10~13.
12. Martinsen B, Horsberg TE, Varma KJ and Sam R(1993). Single dose pharmacokinetic study of florfenicol in Atlantic salmon(Salmo salar) in seawater at 11℃. Aquaculture, 112, 1~11.
13. NIFS(National Institute of Fisheries Science)(2018). Aquatic Medicine Catalog, 44~53.
14. Park BK, Lim JH, Kim MS and Yun HI(2006). Pharmacokinetics of florfenicol and its metabolite, florfenicol amine, in the Korean catfish(Silurus asotus). Journal of Veterinary Pharmacology and Therapeutics, 29, 37~40.
15. Samuelsen OB, Bergh Ø and Ervik A(2003). Pharmacokinetics of florfenicol in cod Gadus morhua and in vitro antibacterial activity against Vibrio anguillarum. Diseases of Aquatic Organisms, 56, 127~133.
16. Seo JS, Jung SH, Jee BY and Kwon MG(2018). The pharmacokinetic characterization of erythromycin thiocynanate in cultured olive flounder by single intramuscular administration. JFMSE, 30(6), 1930~1934.
17. Shojaee AF and Lees P(2000). Antibiotic treatment for animals: effect on bacterial population and dosage regimen optimization. International Journal of Antimicrobial Agents, 14, 307~313.
18. Treves-Brown KM(2000). Tetracyclines. In Applied Fish Pharmacology. Kluwer Academic Publishers, Boston, 64~82.
19. Vue C, Schmidt LJ, Stehly GR and Gingerich WH(2002). Liquid chromatographic determination of florfenicol in the plasma of multiple species of fish. Journal of Chromatography B, 780, 111~117.
20. Yanong RPE and Curtis EW(2005). Pharmacokinetic studies of florfenicol in Koi carp and threespot Gourami Trichogaster trichopterus after oral and intramuscular treatment. Journal of Aquatic Animal Health, 17, 129~137.
21. Zhang Q and Li X(2007). Pharmacokinetics and residue elimination of oxytetracycline in grass carp, Ctenopharyngodon idellus. Aquaculture, 272, 140~145.
22. Zhao HY, Zhang GH, Bai L, Zhu S, Shan Q, Zeng DP and Sun YX(2011). Pharmacokinetics of florfenicol in crucian carp (Carassius auratus cuvieri) after a single intramuscular or oral administration. Journal of Veterinary Pharmacology and Therapeutics, 34, 460~463.