Current Issue

본 시험에 사용된 표준품인 florfenicol(FF)은 Sigma사(USA)를 사용하였고, 기타 HPLC 분석용 시약들은 Merck사의 제품을 사용하였다. 본 실험에 사용한 조피볼락은 이전에 항생제를 사용하지 않은 건강한 조피볼락(Sebastes schlegelii, 590±50 g)을 사용하였으며, 사육 수온은 아쿠아트론을 이용하여 23±1.5 ℃로 일정하게 유지하며 유수식으로 관리하였다. 총 4개의 수조에 5마리 씩 나누어서 관리하였으며 총 20마리를 사용하였다. 실험어류는 약제 투여 하루 전부터 절식하였다.

조피볼락 혈액에서 FF의 약동학적 특성을 조사하기 위하여, 사용 대상 어종의 권장 투여량(10 ㎎/㎏)의 2배에 해당하는 양(20 ㎎/㎏)을 선택하여 실험을 수행하였다. 실험 어류는 약제 투여 하루 전부터 절식하였으며, 어체 중 ㎏ 당 20 ㎎이 되도록 Jung and Seo(2013)의 방법에 따라서 약제 사료를 만들어 강제로 경구 투여하였다. 간단히 설명하면, 경구 투여는 20 마리를 대상으로 1회 실시하였으며 5마리씩 4개의 수조에 나누어서 수용하였다. 투여가 종료된 직후(0 시간)부터 1, 5, 10, 15, 24, 30, 50 및 168 시간마다 5마리로부터 혈액을 채취하였으며, 각 수조에서 1 및 24 시간, 5 및 30 시간, 10 및 50 시간 그리고 15 및 168 시간별로 반복해서 어류로부터 채혈하였다. 실험 어류는 마취 없이 미부혈관으로부터 한 마리 당 혈액 약 1 ㎖를 주사기로 채취, 상법에 따라서 혈청을 분리 후 -80 ℃에 보관하였다가 HPLC 분석에 이용하였다. 더불어, 실험기간 동안 실험 어류에서 총 2회의 반복채혈을 실시하였으나 폐사한 실험 어류는 없었다.

분석기기는 HPLC(Agilent, 1200)을 사용하였으며 기기분석 조건은 <Table 1>에 나타내었다. 간단히 설명하면, 이동상은 acetonitrile과 증류수(D.W.)를 35:65(v/v)의 비율로 주입하였으며, 검출파장은 226 nm, 칼럼(column) 온도는 상온의 조건으로 실시하였다. 조피볼락 혈액에 잔류하는 FF의 전 처리는 [Fig. 1]에서 보는 바와 같다. 간단히 설명하면, 분리된 혈청(serum)의 전 처리는 혈청 200 ㎕에 같은 양(200 ㎕)의 acetonitrile을 넣어 균질화한 다음, 상온에서 10분간 정치하고 원심분리(10,000 rpm, 20 min)를 수행하였다. 얻어진 상등액을 주사기 필터(0.45 ㎛)로 여과해서 HPLC로 분석하였다.

[Fig. 1] 
Extraction process of florfenicol from the serum of Korean rockfish.

FF의 표준곡선 및 회수율 측정은 이전의 논문(Jung and Seo, 2013)에 따라 진행하였으며, 표준용액은 다양한 농도(0.19, 0.39, 0.78, 1.56, 3.12, 6.25, 12.5, 25, 50 ppm)로 이동상에 녹인 표준용액을 HPLC에 20 ㎕ 주입하여 도출된 피크면적에 의하여 표준곡선을 작성하였다. 회수율을 구하기 위해 FF 표준 용액을 0.1, 1 및 10 ppm 농도가 되게 조피볼락 혈청에 첨가한 후, 각 농도 샘플에서 FF를 추출하여 HPLC를 이용하여 분석하였다.

조피볼락에 대한 FF의 경시적 혈중농도는 WinNonlin 프로그램(Pharsight Co., Inc., USA)을 이용하여 One- 및 Two-compartment model로 약동학적 변수(pharmacokinetics parameter)를 조사하였다.

FF의 표준 검량선을 분석한 결과, 농도에 따라 잔류량(peak)의 넓이가 비례하여 유의미한 직선성의 검량선이 작성되었으며 이 결과는 이전의 Jung and Seo(2013)와 유사하게 나타났다. 조피볼락에 대한 회수율을 조사한 결과 0.1, 1.0, 10 ppm에 대하여 각각 73.07±2.59, 92.11±2.04, 79.78±1.18 %로 나타났다. 이 결과는 넙치를 대상으로 회수율 조사를 한 89.21±1.18∼95.01±2.04%보다는 낮게 나타남을 알 수 있었다(Jung and Seo, 2013). HPLC를 이용하여 어류 혈액의 FF 회수율을 조사한 논문에 따르면, 무지개송어(rainbow trout), 배스(striped bass hybrid), 채널메기(channel catfish), 철갑상어(lake sturgeon) 및 호수송어(lake trout)의 혈액에서의 FF 회수율이 평균 84.1∼104.0%(Vue et al., 2002)로 보고되며, 메기(korean catfish)는 89.6∼99.8%(Park et al., 2006), 붕어(crucian carp)는 91.25∼98.37%(Zhao et al., 2011)로 나타났다. 본 논문에서 조피볼락 혈액의 FF 회수율은 평균 73.07∼92.11%로 나타났는데, 이전 연구자들의 회수율과 비교 시 유사한 경향을 나타내었다. 본 연구의 분석방법 검출 한계는 0.05 ppm으로 나타났으며 국내 식품공전에서 규정하는 어류 및 갑각류에 대한 FF의 검출한계 0.05 ppm에서 크게 벗어나지 않았다.

20 ㎎/㎏ 농도로 FF를 조피볼락에 경구 투여한 후 혈청에서의 경시적 농도 변화는 [Fig. 2]에 나타내었다. 경구 투여 후 10시간째 1.11 ㎍/㎖로 최대값을 보였으며, 24시간째는 약 절반의 값인 0.7 ㎍/㎖로 감소하였다. 이후 완만한 소실작용을 보이다가 264시간째는 0.07 ㎍/㎖이었다.

[Fig. 2] 
Concentration (㎍/㎖) of florfenicol in serum of Korean rockfish after single oral medication of 20 ㎎/kg b.w., at 23±1.5℃.

조피볼락의 FF 경구투여에 따른 약동학적 매개변수의 값은 <Table 2>에 나타내었다.

One-compartment로 분석 시 혈중 농도-시간곡선 면적(AUC)은 31.84 ㎍·h/㎖, 최고농도 도달 시간(T_max)은 9.299 h, 혈중 최고농도(C_max)는 1.14 ㎍/㎖로 계산되었으나, Two-compartment로 분석 시 혈중농도-시간곡선 면적(AUC)은 45.52 ㎍·h/㎖, 최고 농도에 도달 시간(T_max)은 9.43 h, 최고농도(C_max)는 1.14 ㎍/㎖로 계산되었다.

어류에 대한 약동학적 연구는 약물 투여량, 공복시간, 약물의 생체 대사 및 약물 배설율 등 같은 여러 인자(factor)에 의존하며(Treves-Brown, 2000), 특히, 사육 수온에 따라 영향을 많이 받으며 잔류기간도 저수온에 비해 고수온에서 현저히 짧아진다고 알려져 있다(Björklund and Bylund, 1990; Zhang and Li, 2007). 국내・외 많은 연구자들이 어류를 대상으로 경구 투여 시 FF의 약동학적 인자 혹은 매개변수 가운데 혈중 농도-시간곡선 면적(AUC), 혈중 최고농도 도달 시간(T_max), 혈중 최고농도(C_max) 항목을 본 연구의 Two-compartment model로 얻어진 수치와 비교한 결과를 <Table 3>에 나타내었다.

일반적으로 약동학적 매개변수는 동일 어종, 투여 방법, 사육수온, 약동학적 분석방법 등에 따라 차이가 나타난다.

동일 어종(대서양 연어)에서 투여량 및 사육수온이 같을 경우 FF를 경구 투여할 시에 크기가 큰 어류가 작은 어류보다 혈중의 FF 농도가 빠르게 고농도로 흡수되는 것으로 보아졌다(Horsberg et al., 1996; Martinsen et al., 1993). 더불어, 동일 어종(koi carp)이지만 투여량 및 투여방법에 따라서도 FF의 경우 근육투여가 경구투여보다 C_max수치가 1.5배의 높은 농도를 나타내었으며(Yanong and Curtis, 2005), 어류를 대상으로 FF를 투여 시 근육투여가 경구투여보다 C_max수치가 높게 나타남을 알 수 있다(Park et al., 2006; Zhao et al., 2011)

본 연구에서는 증명하지 못하였으나, 향후 조피볼락에 대한 FF의 투여 회수, 투여방법별 및 사육 수온별로 다양한 약동학적 연구가 더 심도 있게 진행되어야 하겠다.

어류 질병을 치료하기 위하여 항생제인 FF를 투여 시 치료 효능을 높이기 위해서는 조직 내 분포하는 약물농도와 지속기간이 중요하다. 본 연구 결과에서 허가받은 용량보다 2배 많은 용량으로 조피볼락에 경구 투여 시 혈중 농도가 1.2 ppm으로 나타났다. 이전 논문(Jung and Seo, 2013)에 의하면 국내 조피볼락에서 분리된 병원체 세균인 Photobacterium damselae subsp. damselae와 Lactococcus garivae의 Minimum inhibitory concentration(MIC)가 각각 3.13 및 1.56 ppm으로 보고되었다. 어류의 혈중농도와 약물의 치료효능이 직접적인 상관관계를 나타내는 것은 아니나, 이전 논문(Shojaee and Lees, 2000)의 논문에 따르면 의약품은 MIC의 1배~2배 이상의 농도로 혈중 내에서 일정기간 동안 유지하여야 치료 효능이 있다고 알려져 있다. 따라서, 향후 추가 연구를 통해 1회 투여가 아닌 5일 연속 및 허가 용량의 2배 이상의 투여 시 조피볼락 혈중 및 근육에서의 잔류량을 측정하여 FF의 안전하고 유효한 용법ㆍ용량 및 휴약 기간 등을 확보하여야 할 것으로 보아지며, 이를 통해서 실제 양식장에서 조피볼락 현장 적용을 위한 용법・용량 등 가이드라인을 명확히 제시할 수 있으리라 본다.