Current Issue

효능과 안전성이 확보된 생약 중 시중에서 많이 이용하고 판매중이며, 기존에 Choi et al.(2004)에서 연구된 생약소재를 제외하고 항생제 대체제로 개발 가능성이 높은 생약소재 13종을 후보물질로 선정하여 실험에 사용하였다. 선정된 13종(길경, 당귀, 마치현, 맥문동, 산미나리, 산약, 인진, 야관문, 작약, 천궁, 치자, 하수오, 헛개나무)의 학명과 사용부위를 <Table 1>에 정리하였고, 이 생약들은 대한민국 생약으로 가능한 물질 중에서 대한민국약전외 한약규격집에 등재된 성분을 대상으로 선정하였다.

생약소재는 사용 전에 증류수로 깨끗하게 씻어 수분을 날린 후 사용하였다. 열수 추출물은 생약 중량 10 g에 증류수(DW) 100 ml로 6시간 동안 끓여 농축된 원액을 사용하였고, 에탄올 추출물은 생약 10 g을 99.9 % 에탄올로 각각 초음파 추출(3회 반복) 한 후, 농축 잔류물을 증류수 10 ml에 녹여 추출물 원액으로 사용하였다.

14종의 어병세균(<Table 2>)에 대한 항균활성은 MIC(Minimal inhibitory concentration)법을 사용하였다. 각 어병세균에 대하여 0.5 McFland standard와 동일하도록 농도를 조절하였으며(Koneman et al., 1997), 농도로 맞춰진 균액과 단계별 희석농도(1/10, 1/10², 1/10³, 1/10⁴)로 조절된 생약 추출물 첨가액을 동량(1:1)으로 배합하여 25 ℃에서 overnight 배양한 후 0.2 mg의 p-idonitrotetrazolium violet을 첨가하여 2시간 동안 배양하였다. 그 후 붉은색으로 발색되지 않는 최소억제농도(MIC)를 조사하였다(Langfield et al., 2004).

생약의 항기생충 활성을 조사하기 위해 해산 양식어에서 대표적으로 나타나는 기생충인 스쿠티카충(Miamiensis avidus)을 실험에 사용하였다. 넙치에서 분리 후 본 연구실에서 배양 중인 스쿠티카충을 어류세포주(CHSE-214)에 접종하여 20 ℃에서 3~5일정도 배양하였다. 배양된 스쿠티카충을 동량의 농도별 생약 추출물(1/10, 1/10², 1/10³, 1/10⁴)에 첨가하여 20 ℃배양기에서 10분, 20분, 30분, 1시간, 2시간 3시간 간격으로 살충여부(충체의 사멸정도, 움직임, 세포질 파괴정도)를 관찰하였다.

항진균 활성을 조사하기 위하여 뱀장어에서 분리된 수생균(Saproleginia spp.)을 사용하였다. SDB(Sabouraud dextrose broth)에 생약 추출물을 농도별(1/10, 1/10², 1/10³, 1/10⁴)로 첨가한 배지와 첨가하지 않은 일반 SDB를 제조한 후, 전배양한 수생균 한천조각을 동일한 크기로 준비하여 접종하고 15 ℃에서 일주일 동안 배양하면서 수생균의 발육을 관찰하였다. 추출물 첨가 없이 배양한 대조구의 수생균의 발육상태와 생약 추출물이 함유된 배지에서의 발육정도를 균사가 자라는 길이(cm)로 비교하였다.

항바이러스 활성에 대한 조사에는 어류주화세포(CHSE-214)에 농도별로 희석한 생약 추출물(1/10, 1/10², 1/10³, 1/10⁴)을 함유한 배지를 첨가하고 넙치에서 분리한 VHSV(Viral hemorrhagic septicemia virus)를 TCID₅₀농도로 접종하여 15 ℃ 배양기에서 1주일간 배양하면서 CPE(cytopathic effect, 세포변성효과) 생성 여부를 관찰하였다.

13종의 생약 추출물에 대한 항균활성은 인진을 제외하고 나머지 생약에서 항균활성이 미비하게 나타났다. 인진의 경우 어병세균 14종에 대한 항균활성 조사 결과, 열수 추출물과 에탄올 추출물 이 동일하게 E. tarda를 제외한 13균주에서 1/10 및 1/10² 희석에서 유효한 항균효과(MIC)를 나타내어 높은 항균활성을 보였으나, E. tarda균에서만 1/10 희석에서 항균활성을 나타냈다 (<Table 2>). 13종의 후보물질 중에서 인진이 항균활성이 가장 높게 나타나 항균물질로 선정하였다.

13종의 생약 추출물에 대한 항기생충 활성에 대해서는 열수 추출물과 에탄올 추출물 모두 길경, 인진, 당귀의 추출물에 대해서만 그 효과를 확인할 수 있었고, 나머지 10종에 대해서는 효과가 없는 것으로 나타났다(<Table 3>). 길경, 인진, 당귀의 1/10 희석농도에서는 10분 처리에도 기생충이 세포질이 터지고 모두 사멸하는 효과를 보였고, 그 중 당귀 추출물을 1/10³ 희석농도에서 3시간 동안 반응시켰을 때 기생충의 활성이 20 % 저하되었으며, 1/10² 희석농도에서는 기생충 활성이 40 %까지 저하되어 당귀가 후보물질 중에서 항기생충 효능이 가장 높게 나타났다.

13종의 생약 열수 추출물에 대한 항진균 활성에 대해서는 일반 SDB배지에 수생균만 접종한 대조구와 비교하여 균사의 성장이 절반 이하로 억제되는 것을 항진균 활성의 기준으로 판단하였다. 그 중 인진, 치자, 작약 그리고 마치현의 경우 1/10 희석농도에서, 그리고 당귀 열수 추출물은 1/10² 희석농도에서 항진균 활성이 나타났다.

에탄올 추출물의 경우는 인진, 당귀 및 작약에서 1/10², 1/10³ 희석농도에서 항진균 활성을 나타났으며, 효능성을 나타낸 후보물질 중에서 당귀가 항진균 활성이 가장 높게 나타났다(<Table 4>).

CHSE-214 어류 주화세포주에 VHS 바이러스를 접종하여 1주일 동안 세포변성(CPE)을 관찰한 결과, 13종의 생약 추출물 가운데 인진 열수 추출물과 에탄올 추출물에서 1/10³ 희석농도까지 CPE가 관찰되지 않았고([Fig. 1]), 당귀 열수 추출물 및 에탄올 추출물에서도 1/10³ 희석농도까지 CPE가 관찰되지 않았다. 나머지 11종의 생약 추출물에서는 항바이러스 효과가 없는 것으로 확인되어 인진과 당귀가 항바이러스 효능이 있는 것으로 나타났다.

[Fig. 1] 
A week cultured CHSE-214 cell line. 1; Normal cell, 2; VHS injected normal cell, 3; VHS injected cell containing 1/10³ In-jin extract.

항균 활성은 인진에서만 확인되었고, 항기생충 활성은 길경, 인진, 당귀에서 효능이 확인되었으며 이 중에서 당귀의 효능이 가장 좋았다. 항진균 활성은 인진, 치자, 당귀, 작약, 마치현에서 효능을 나타내었지만, 당귀가 가장 높은 효능을 나타내었고, 항바이러스 활성은 인진과 당귀에서만 확인되었다. 이상의 결과에서 본 연구에서 검토한 13종의 생약 가운데 수산생물병원체들을 구제하는데 높은 효능을 나타낸 것은 인진과 당귀였다. 열수 추출물과 에탄올 추출물이 병원체에 대한 효능에서는 차이를 보이지 않았지만 진균에 대해서는 열수 추출물보다 에탄올 추출물이 조금 더 높은 효능을 나타내었다.

생약 추출물의 경우 추출방법이나 추출부위에 따라 주요성분에 차이를 보이는 것이 일반적이다(Gergerson et al., 2005; Hu et al., 2009; Heo et al., 2010). 본 연구에 사용된 인진(Artemisia iwayomogi Kitamura; 한인진=더위지기)의 경우 항산화 기능을 나타내는 polysaccharide 성분이 열수 추출물에서 보고되었으며(Ahn and Jung, 2011), 에탄올 추출물에서는 inflammatory cytokines의 발현을 억제하거나 adipogenesis에 관여하는 성분이 많음이 보고 되었다(Choi et al., 2013). 본 연구에서 사용된 당귀는 참당귀(Angelica gigas Nakai; 토당귀)로 중국당귀(Angelica acutiloba Kitagawa) 또는 일본당귀(Angelica sinensis Diels)와는 구분된다. 우리나라에서 생산되는 참당귀는 산형과(미나리과) 식물로 꽃피기 전에 뿌리를 건조하여 약용으로 쓰고, 함유성분으로는 coumarin계의 decursin, decursinol angelate와 nodakentin, umbelliferon, β-sitosterol 등이 알려져 있다(Ahn et al., 1996). 항산화, 항암효과 및 면역활성과 같은 기능성을 조사한 연구에서 참당귀의 메탄올 추출물이 항산화활성은 가지지만 면역활성에 대한 관련성은 없으며 암세포를 사멸시키는 것으로 보고하였다(Park et al., 2007).

Heo et al.(2010)은 항염증효과가 있는 것으로 알려져 있는 decursin은 참당귀 뿌리의 에탄올 추출물에서 높게 검출된다고 보고되었다.

2000년도 이후 양식생물의 질병 추세는 수산생물병원체(세균, 기생충, 바이러스 등)의 단독 발생보다는 세균과 기생충 또는 세균과 바이러스의 혼합감염의 추세가 많이 나타나며(Kim et al, 2010), 이런 질병감염은 단독감염에 비해 치료가 어렵다. 특히 초기에 신속하고 빠른 치료가 이루어지지 않으면 대량폐사로 이어질 가능성이 높다. 그러므로 질병치료 혹은 면역기능 향상을 위해서 항균활성이 가장 높게 나타난 인진과 항기생충 활성이 가장 높은 당귀, 그리고 항바이러스 활성에서도 인진과 당귀가 높게 나타나, 이상의 결과를 토대로 인진과 당귀를 합치면 수산생물병원체에 대한 항병성을 높이는 생약소재로 활용이 가능할 것이라 사료된다. 추가적으로 실효성 있는 활용을 위해 대상개체에 대한 후속연구가 수행된다면 향후 수산용 의약품으로 개발에 대한 가능성을 높일 수 있을 것이라 생각된다.