Journal Archive

이 연구에서 사용된 표준품 Erythromycin thiocyanate는 Clearsynth 사(USA)를 사용하였고, 실험어에 투여된 약품은 erythromycin thiocyanate(순도 76%; 대성미생물)를 사용하였다.

LC/MS/MS 분석을 위한 용매류인 acetonitrile, methanol 및 증류수 등은 Merck 사(Germany)를 사용하였으며, 기타 이 실험에 사용된 모든 시약은 특급 이상을 사용하였다.

본 실험에 사용한 넙치는 항생제 투여 경력이 없는 건강한 넙치(평균체중 332±20 g, 150 마리)를 사용하였고 사육수온은 아쿠아트론을 이용하여 20±0.5℃로 일정하게 유지하였다.

건강한 넙치(평균체중 332±20 g)를 실험수조에 옮겨 2주 동안 순치시킨 후, 실험구 당 36마리씩 수용하여 20℃로 설정한 사육수온에서 증류수에 희석하여 어체 중 ㎏ 당 5, 10 ㎎이 되도록 근육 상부에 100 ㎕로 1회 주사하였다. 투여 후 1, 3, 6, 9, 24, 72, 120, 168, 264, 360, 504, 720시간까지 5마리씩 미부정맥으로부터 1.0~3.0 ml씩 채열 하여 혈장 분리 후 -80℃에 보관하였다가 분석에 사용하였다.

분석기기는 LC/MS/MS(Agilent, 6430)를 이용하였으며 분석조건은 <Table 1>에 나타내었다. 간단히 설명하면, 초기 이동상은 A 이동상 및 B 이동상 용매를 80:20의 비율로 주입하다가 10분 후 50:50으로 점진적으로 증가시킨 후 다시 초기 이동상으로 하여 20분간 주입하였다. 샘플은 Seo et al.(2014)의 방법에 따라 혈장 200 ㎕에 동량의 acetonitril을 가하여 혼합한 후 10분 동안 방치 후 원심분리(10,000 rpm, 20 min)하여 상등액을 여과필터(0.45 ㎛) 후 LC/MS/MS분석하였다.

그리고 EM의 경시적 혈중농도는 WinNonlin program(Pharsight Co., Inc., USA)이용하여 약물동태학적 매개변수를 조사하였다.

EM의 표준곡선 및 회수율 측정은 이전의 논문(Seo et al., 2014)에 따라 진행하였으며 표준용액은 다양한 농도(5∼200 ng/㎖)로 희석하였으며, 회수율은 EM의 표준용액을 10, 50, 100 ng/㎖의 농도로 넙치 혈청에 첨가한 후, EM을 추출하여 LC/MS/MS로 분석하였다.

EM 표준 검량선은 표준용액을 acetonitrile로 5, 10, 20, 100, 200 ppb로 희석하여 LC/MS/MS로 분석한 결과 농도에 따라 직선성(r² 값)은 0.9997을 나타내었다(data not shown). 이 결과는 이전의 Seo et al.(2014)와 동일하게 나타났으며, 또한 검출한계, 정량한계 및 회수율도 유사하게 나타났다. 본 실험방법은 여러 어종의 근육 및 혈청을 대상으로 한 결과(Park et al., 2008; Salvo et al., 2014)와 유사하며, 실험 방법의 유의성을 조사하였을시에 분석 방법이 안정적임을 알 수 있었다.

EM은 국내에서 연어과어류의 세균성신장병, 연쇄구균병 및 방어의 연쇄구균병 치료(Treves-Brown, 2000)에 사용되도록 품목 허가가 승인되어져 있으나, 실제 양식 넙치 및 조피볼락의 세균성 질병 치료에 많이 쓰이고 있다(NIFS, 2016). EM은 현재 경구 투여로만 승인되어져 있으나 국내에서는 수산질병관리사 등의 처방 하에서 투여 방법을 변경을 할 수 있다. 따라서 EM을 근육투여 방법으로 투약 시 어체 내 약물대사 작용을 분석하기 위해 혈청으로 경시적 농도변화를 관찰하였다([Fig. 1]).

[Fig. 1] 
Concentration (μg/ml) of EM in serum of olive flounder after intramuscular injection of 5 and 10 ㎎/kg b.w., respectively.

EM을 넙치 근육에 투여 시 최대 혈중 농도는 투여 후 빠르게 감소하였다. EM의 무지개송어, 방어, 감성돔에 대한 경구투여 시 혈중 최고 농도가 다양한 시간대인 3∼9시간으로 나타나며 24시간 이후에 급격한 감소를 나타낸다고 알려져 있다(Katae et al., 1980; Salvo et al., 2013, 2014). 본 연구에서 EM을 넙치 근육투여 시에는 이전 논문들보다 빠르게 소실됨을 알 수 있으며, 이는 투여방법의 차이로 보아지며 이전 논문에서 EM을 넙치에 경구투여(50 mg/kg b.w로 5일 동안 연속투여) 시 혈중에서 0.2 ppm이상의 혈중 농도가 11일 유지된다고 보고되었다(Seo et al., 2014). 이는 넙치의 EM 경구 투여는 넙치의 혈중 배출속도가 어종의 낮은 활동성으로 인해 체내물질대사 속도가 느린 것으로 추정하나, 근육 투여는 빠르게 소실됨을 알 수 있었다(Seo et al., 2014). 국내에서 양식 어류의 세균성 질병 치료·예방을 위하여 에리스로마이신의 경구투여는 에리스로마이신(Erythromycin thiocyanate), 설파디아진(Sulfadiazine sodium) 및 트리메토프림(Trimethoprim)의 복합제가 주로 판매되며, 이는 복합제가 단일제보다 경구투여에 따른 치료효능이 좋아 제품수가 많은 것으로 추정된다(NIFS 2016).

국내 양식 넙치의 주요 세균성질병인 연쇄구균병 치료제로서의 EM 근육투여는 혈중 내 0.5 ㎍/㎖ 이상으로 유지하여야만 효능효과를 나타낸다고 알려져 있다(Lee et al., 2008; Seo et al., 2014). 약동력학 분석을 통하여 EM은 Non-compartment analysis로 빠르게 소실되는 경향을 나타내었다. 최고혈중농도(C_max) 및 최고혈중농도 도달시간(T_max)은 투여 후 바로 소실되어 매우 낮은 시간대로 나타났으며, 이는 이전의 경구투여 결과와는 확연히 다르다(<Table 2>). 이전 논문(Seo et al., 2014)에서 넙치를 대상으로 EM을 1회 경구투여(50 mg/kg b.w)한 결과에 따르면 약물동태학적 특성은 two-compartment model로 나타나며, 최고혈중농도(C_max)는 34 ㎍/㎖, 혈장농도-시간곡선하면적(AUC)이 165.3 hr·㎍/㎖로 나타나 EM 근육투여는 경구투여보다 빠르게 소실되는 경향이 있다. 일부 연구에서 EM의 근육투여의 흡수율을 올리기 위하여 erythromycin base 형태로 만들어 투여 방법을 연구하거나 혹은 복강투여 방법을 연구하기도 하였다(Brown et al., 1990; Creeper and Buller, 2006; Treves-Brown, 2000). 그러나, 어류에 대한 EM 근육 투여 방법에 대한 연구는 거의 수행되지 않았으며, 일부 연구도 약물동태학적 특성은 조사되지 않았으며, 투여방법에 따른 치료 효능 연구에 중점을 두고 있다(Brown et al., 1990; Moffitt 1992).

EM은 어병치료제로 경구투여 방법이 주로 사용되어 왔으나, 이 항생제는 어류의 위산에 의하여 파괴가 잘되고, 반감기(1~1.5)가 매우 짧은 약물이므로 향후 주사와 같은 다른 투여방법에 의한 유효성 및 안전성 연구가 필요할 것으로 사료된다.