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검사에 제공된 강준치(4마리)는 2016년 2월에 경북 낙동강 칠곡보 하류에서 채집된 것으로, 평균체중 87.3g(73~113g), 평균전장 27.3cm (25.0~29.5g)였다. 강준치 4마리 중 1마리는 가슴지느리미 뒷부분의 천공된 부분을 통하여 조충의 일부분이 몸 밖으로 나와 있었으며([Fig. 1a]), 부검하였을 때 모든 검사체의 복강에서 조충이 발견되었다.

[Fig. 1] 
The features of Erythroculter erythropterus infected with Digramma interrupta. (a) Appearance of E. erythropterus after death by cestodas infection. (b) Fish abdomen full of tapeworms (c) Abdominal cavity of fish after removing tapeworms. The tapeworm is penetrating the intestine of E. erythropterus.

조충의 동정을 위해 18S rRNA 유전자를 증폭할 수 있는 primer를 Ligula 속 조충의 18S rRNA 유전자를 기초로 제작하였다. Ribosomal RNA 유전자는 진핵생물의 분자생물학적 분류에 주로 사용되는 유전자이다. National Center for Biotechnology International (NCBI) GenBank에 등록된 L. intestinalis의 유전자 염기서열정보를 이용하여 LGL-18s-F(5’-TTTCGGAAGGACATTACACG-3’), LGL-18s-R(5’-TGATCCACCGCATAGAGTTG-3’) primer를 설계하였다.

PCR(Polymerase Chain Reaction)을 위해 강준치의 복강에서 분리된 조충을 100% 에탄올에 고정하여 보관한 후, 조충 조직 50mg을 PBS에서 균질화하여 DNA를 추출하였다. DNA 추출은 QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN, USA)를 사용하였으며, 제조사의 매뉴얼에 따라 수행하였고 추출된 DNA는 사용할 때까지 -80℃에 보관하였다. PCR mixture는 Accupower®PCRpremix(Bioneer, Korea)를 사용하여 primer set 각각 0.1μM과 1㎕의 DNA, DEPC-D.W.를 넣어 전체부피가 20㎕ 되도록 하여 PCR을 실시하였다. 반응 조건은 초기변성단계 94℃ 5분 뒤, 변성단계 94℃ 30초, 결합반응 55℃ 30초, 증폭반응 72℃ 40초를 총 30회 반복한 후 72℃에서 7분간 반응하였다. PCR product는 EtBr이 포함된 1.5% agarose gel에서 전기영동하여 확인하였다.

PCR 증폭이 확인된 시료는 Solgent(Korea)에서 sequencing하여 염기서열을 비교분석 하였다. 유전자 염기서열 분석은 BioEdit ver.7.2.1과 MEGA ver.5.2를 사용하였으며, Forward/Reverse 각각의 primer로 얻은 raw sequence를 assembly하였다. NCBI의 Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)을 활용하여 보고된 조충의 유전자와 sequencing 결과의 상동성을 분석하였다. 본 연구에서 확인된 조충의 18S rRNA 유전자는 MEGA 프로그램의 Maximum-likelihood(ML) 방법을 사용하여 계통 발생학적으로 분석하였다.

강준치의 복강 내에는 옅은 아이보리색의 가늘고 긴 밴드 형태의 조충이 3 또는 4마리씩 모든 장기를 감싸듯 복강을 가득 채우고 있었고([Fig. 1b]), 장을 관통하여 기생하는 경우도 1마리 관찰되었다([Fig. 1c]). 조충의 길이는 11.0~41.5 cm(26.1±10.7 cm) 이었고 무게는 1~8g(3.9±2.0 g) 이었다. 조충의 외형을 관찰하기 위해 알코올에 고정된 조충 가운데에서 관찰이 용이한 짧은 개체를 선택하여 실체현미경으로 관찰하였다([Fig. 2a]).

[Fig. 2] 
Morphology of cestoda isolated from Erythroculter erythropterus in Korea. (a) A whole cestoda shape (b) Tail (c) Body (d) Head. Tapeworms was observed under microscope.

조충의 두부, 미부, 몸통을 관찰하였는데, 두부에는 흡반, 돌출부, 갈고리와 같은 기관이 없으며 끝은 가늘고 잘린듯한 미끈한 형태이며([Fig. 2d]), 두부의 두절이나 몸통의 편절과 같은 체절이 몸 전체에서 관찰되지 않았으며, 몸통에는 얕은 주름이 가로로 관찰되었다([Fig. 2b~2d]). 몸통의 가장 넓은 부분인 미부는 세로로 두 줄의 홈이 관찰 되었고([Fig. 2c]) 끝은 넓고 뾰족한 동물의 혓바닥 같은 형태였다([Fig. 2b]).

조충의 유전자 염기서열 분석에서, 18S rRNA 유전자를 대상으로 한 PCR에서 559bp 크기의 산물이 증폭되었고, 증폭된 PCR 산물의 염기서열(accession number : MH935206)을 DNA의 blastn 분석을 실시하였다. 강준치에서 분리된 조충은 모두 Digramma sp.(accession number : AF354291) 18S rRNA 유전자와 519개의 염기서열 중 519개가 모두 일치하여 100%로 상동성이 가장 높았고, D. interrupta(accession number : AF254122)가 두 번째로 높은 99.6% 상동성을 보여 국내 강준치에서 분리된 조충은 Digramma 속의 D. interrupta라고 할 수 있다.

[Fig. 3] 
PCR amplication results using 18S rRNA gene primers in cestoda. Lane M indicates 1,000bp DNA ladder. Lane 1~3 are genomic DNA extracted from cestoda. The number determines the sort order of randomly selected three cestoda.

강준치에서 분리된 조충은 18S rRNA 염기서열을 이용한 계통 발생학적 분석 결과에서도 어류에 기생하는 Diphyllobothriidae 중에서 Digramma 속(genus)의 D. interrrupta와 근연 관계를 보였다([Fig. 4]). D. interrrupta는 이란과 중국이라는 분리지역에 유전적 차이를 보였는데, 국내에서 분리된 Digramma sp.는 중국에서 분리된 D. interrrupta와 99.6%, 이란에서 분리된 것과 98.8% 유사하여 중국에서 분리된 D. interrrupta와 유사하였다. 일본에서 분리된 D. interrupta의 유전적 정보는 없어 이번 연구에서 유전적인 비교를 할 수 없었지만, 일본에서 D. interrupta가 황어(Tribolodon hakonensis), 끄리속(Opsariichthys platypus), 은붕어속(Carassius sp.), 잉어(Cyprinus carpio), 납자루속(Acheilognathus sp.), 중고기속(Sacocheilichthys variegatus micriiculus), 연어속(Oncorhynchus sp.)에서 보고되어(Nagasawa, 2015) 지리적으로 가까운 한국, 중국, 일본에 D. interrrupta가 분포하는 것을 알 수 있었다.

[Fig. 4] 
Neighbor-joining phylogenetic analysis of Diphylobothriidae family and 18S rRNA gene sequences associated with Digramma sp.. The isolation country of the Diphylobothriidae family is indicated right side. The sequences were secured form NCBI GenBank and the representative name contains the accession number. The scale bar indicates the expected number of substitution per site.

D. interrupta는 이란에서 브림(Abramis brama) 558마리 가운데 67마리(16%)에 기생하고 있었고 Alburnoides bipunctatus 883 마리 가운데 418마리(63%)에 L. intestinalis가 기생하고 있어 종 특이성이 있었다(Ahmadiara et al., 2013). 국내의 경우는 피라미에서 L. intestinalis가 복강에 기생한 것이 보고되었으나(Shin et al., 2016) D. interrupta가 보고된 예는 없다. 조충류 중에서 광절열두조충(D. latum)과 요나고열두조충(D. yonagoense)은 어류를 감염원으로 하여 사람에 기생하지만(Chai, 2010) D. interrupta가 사람에서 발견된 사례는 국내외에 없어 D. interrrupta는 인수공통병원체가 아닌 것으로 생각된다.

이번 연구로 강준치에서 분리된 조충은 18S rRNA 유전자를 이용한 분석으로 D. interrupta로 동정되었고, 감염 경로에 관한 추가적인 연구가 필요하다고 판단된다.