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본 실험에서 사용한 연자육(Nelumbo nucifera) 및 벌꿀은 2019년 1월 경남 창원시 소재 약재상에서 구입하였으며, 붕어(Carassius carassius)는 경남 창원시 소재 주남저수지에서 2019년 1월 어획된 체중 721~1,083 g (평균 902 g), 체장 30.6∼37.6 cm (평균 34.1 cm), 체고 11.4∼13.6 cm (평균 12.5 cm)인 살아 있는 자연산 붕어를 구입하여 사용하였다. 붕어고음 농축액 제조에 사용된 천연 식물류(당귀, 천궁, 황기, 작약, 숙지황, 복령, 백출, 계피, 감초, 하수오, 익모초, 가시오가피 열매, 헛개 열매, 대추, 생강, 황정초, 산사, 맥아, 콩, 칡, 신곡 및 도라지)는 경남 창원시 소재 약재상에서 구입하여 사용하였다.

연자육은 150~170℃로 예열된 볶음기(SS-H010, Shinsung FM Co. Ltd., Ansan, Korea)에 넣어 20분간 볶은 후 실온으로 식힌 다음, 곡물분쇄기(GRC-10, Garyeo Industrial Co. Ltd., Siheung, Korea)를 이용하여 180~200 mesh로 분말화하여 사용하였다.

붕어고음 농축액은 [Fig. 1]과 같은 공정에 따라 제조하였다. 먼저 붕어 16 kg을 흐르는 물에서 48시간 동안 해감시킨 후 내장을 제거하고 깨끗이 세척하였다. 전기식공압추출기(55 L, Dongnam Industrial Co. Ltd., Yangsan, Korea)에 전처리한 붕어(12 kg)를 삼베보자기에 싸서 넣은 후 붕어 중량의 2배에 해당하는 물(24 L)을 첨가하여 120℃에서 8시간 1차 가열하였다(Park et al., 2017). 여기에 천연 식물류(당귀, 천궁, 황기, 작약, 숙지황, 복령, 백출, 계피, 감초, 하수오, 익모초, 가시오가피 열매, 헛개 열매, 대추, 생강, 황정초, 산사, 맥아, 콩, 칡, 신곡 및 도라지)의 총량이 붕어 중량에 대해 20%(2.4 kg)가 되도록 첨가한 후 120℃에서 8시간 동안 2차 가열하였다.

[Fig. 1] 
Flowsheet of processing of concentrated crucian carp extracts.

다음 120℃에서 2시간동안 탈기하고 여과한 후 상층부의 기름을 제거하여 붕어고음을 제조하였다(Park, 2019). 이를 초고속진공저온농축기(Cosmos-700, Kyungseo Industrial Co. Ltd., Incheon, Korea)로 농축(95℃, 14시간) 하여 붕어고음 농축액을 제조하였으며, 최종 농도는 45.1±3.7°Brix였다.

붕어고음 농축액 함유 연자육 환제는 소환의 경우 경질 제품, 대환의 경우 연질 제품으로 구분하여 제조하였다. 붕어고음 농축액이 함유된 연자육 환제의 제조공정은 [Fig. 2]와 같이 소환은 연자육 분말 55%, 붕어고음 농축액 15% 및 벌꿀 30%를 배합기(KV-5, Koreamedi Co. Ltd., Daegu, Korea)에서 잘 혼합한 후, 26~33℃에서 4시간 동안 숙성시켰다. 이를 자동제환기(GR-15A, Garyeo Industrial Co. Ltd., Siheung, Korea)에서 환제 1개의 중량이 0.08~0.10 g이 되도록 만든 후 45~50℃의 열풍건조기(GRD-112, Garyeo Industrial Co. Ltd., Siheung, Korea)에서 4시간 동안 건조하여 제조하였다. 대환은 연자육 분말 50%, 붕어고음 농축액 15% 및 벌꿀 35%를 상기와 동일하게 혼합 및 숙성시킨 후 자동제환기에서 환제 1개의 중량이 약 5 g이 되도록 만든 다음 45~50℃의 열풍건조기에서 2시간 동안 건조하여 제조하였다. 완성된 환제는 [Fig. 3]과 같다.

[Fig. 2] 
Flowsheet of processing of lotus seed pills containing concentrated crucian carp extracts.

[Fig. 3] 
Lotus seed pills containing concentrated crucian carp extracts.

Size of the pills were 0.08~0.10 g (weight) and 0.73~0.84 mm (diameter) in small pill, about 5.00 g (weight) and 4.27~5.06 mm (diameter) in large pill, respectively.

붕어고음 농축액 함유 연자육 환제(소환 및 대환)를 각각 분쇄한 후 20 g을 취하여 물 추출물은 증류수를, 에탄올 추출물은 80% 에탄올을 각각 200 mL씩 첨가하여 60℃에서 3시간 동안 추출하였다. 이를 2회 반복 추출한 다음 여과하여(Whatman No. 1) 회전식 진공증발농축기(RW-0528G, Lab. Companion, Korea/ GITAL　WATER BATH SB-1000, EYELA. Japan/ RPTARY EVAPOPATPR N-1000, EYELA, Japan)로 건조시켰다.

이때 각 추출물의 수율은 소환의 물 추출물은 58.2%, 에탄올 추출물은 35.6%이었으며, 대환의 물 추출물은 60.4%, 에탄올 추출물은 34.0%였다.

환제의 배합비 선정을 위해 제형의 유지 및 관능적 기호도를 고려한 관능평가를 실시하였다. 10인의 관능평가 요원(남자 6명, 여자 4명, 20~50세)을 구성하여 연자육 분말의 배합비를 달리한 소환 및 대환의 색, 풍미, 맛, 조직감 및 전반적인 기호도에 대해 5단계 평점법(5: 아주 좋음, 4: 좋음, 3: 보통, 2: 싫음, 1: 아주 싫음)으로 평가하였으며, 평가점수 중 최고 및 최저값을 제외한 나머지 점수의 평균값으로 계산하였다.

환제의 일반성분은 AOAC(1995)법에 따라, 수분은 105℃ 상압가열건조법, 회분은 550℃ 건식회화법, 조단백질은 semimicro Kjeldahl법, 조지방은 Soxhlet법으로 각각 정량하였으며, 탄수화물의 함량은 100-(수분+회분+조단백질+조지방의 함량)으로 계산하였다.

분쇄한 환제를 일정량 취하여 진한 황산과 질산을 각각 10 mL씩 가하여 hot plate상에서 완전 분해시킨 다음 증류수로 희석하여 Inductively Coupled Plasma (ICP, Optima 3300 DV, Perkin-Elmer Co., Melville, NY, USA)로 분석하였다.

구성아미노산은 분해용 시험관에 분쇄한 환제 0.5 g을 취한 후 6 N HCl 3 mL를 혼합하고 7분간 질소가스를 충전시킨 후 110℃ heating block에서 24시간 분해한 다음 여과하여 농축하였으며, 이를 pH 2.2 sodium citrate 완충용액으로 10 mL로 정용한 후 0.2 μm membrane filter와 sep-pak C18 cartridge에 여과시켜 아미노산 자동분석기(Amino acid analyzer 835, Hitachi, Tokyo, Japan)로 분석하였다.

총 페놀 함량은 환제의 물 및 에탄올 추출물을 재용해한 시료액 1 mL에 Folin-ciocalteu 시약 0.5 mL를 혼합한 후 3분간 반응시킨 후 10% Na₂CO₃용액 1 mL를 가하여 실온의 암실에서 1시간 반응시킨 후 700 nm에서 흡광도를 측정하였다(Gutfinger, 1981). 플라보노이드 함량은 상기의 시료액 1 mL에 10% aluminum nitrate 0.1 mL, 1 M potassium acetate 0.1 mL 및 80% ethanol 4.3 mL를 차례로 가한 후 실온의 암실에서 40분간 반응시킨 후 415 nm에서 흡광도를 측정하였다(Moreno et al., 2000). 총 페놀 및 플라보노이드 정량은 표준물질로 각각 gallic acid 및 quercetin (Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA)을 사용하여 얻은 표준검량선으로 부터 계산하였다.

항산화 활성은 DPPH (1,1–diphenyl–2–picrylhydrazyl), ABTS [2,2'–azinobis–(3–ethylbenzothiazoline–6–sulfonate)] 라디칼 소거활성 및 환원력으로 측정하였다. DPPH 라디칼 소거활성은 DPPH 용액(8 mg/100 mL 메탄올) 100 μL와 상기의 시료액 80 μL를 혼합하여 실온에서 10분간 반응시킨 후 525 nm에서 흡광도를 측정하였다(Blois, 1958). ABTS 라디칼 소거활성은 7 mM ABTS용액에 potassium persulfate를 2.4 mM이 되도록 용해시켜 냉암소에서 12∼16시간 반응시킨 다음 414 nm에서 흡광도가 1.5가 되도록 증류수로 희석한 것을 ABTS 기질용액으로 하였으며, 이 용액 100 μL에 시료액 50 μL를 가하여 실온에서 5분간 반응시켜 414 nm에서 흡광도를 측정하였다(Re et al, 1999). 라디칼의 소거활성(%)은 [1-(시료 첨가구의 흡광도/무첨가구의 흡광도)]×100으로 계산하였다. FRAP (ferric-reducing antioxidant potential ability)에 의한 환원력은 시료액 40 μL, 증류수 40 μL, FRAP 기질용액 100 μL를 차례로 혼합하여 37℃에서 4분간 반응시켜 593 nm에서 흡광도를 측정하였으며, FeSO₄ㆍ7H₂O를 표준물질로 하여 작성한 검량선에 의해 계산하였다. 이때 FRAP 기질용액은 pH 3.6의 300 mM acetate 완충용액, 10 mM TPTZ-40 mM HCl 용액, 20 mM ferric chloride를 각각 10:1:1(v/v/v)의 비율로 혼합한 후 37℃ water bath에서 5분간 반응시킨 것을 사용하였다(Benzie and Strain, 1996).

실험결과는 SPSS 12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 프로그램을 이용하여 산출하였으며, 실험구별 유의성 검정은 Student t-test 및 일원배치 분산분석(one-way analysis of variance)을 한 후 P<0.05의 유의수준에서 Duncan's multiple range tests로 사후검정을 하였다.

붕어고음 농축액 함유 연자육 환제의 최적 배합비를 설정하기 위하여 연자육 분말, 붕어고음 농축액 및 벌꿀을 4가지 조건으로 혼합하여 제조한 후 관능평가를 실시한 결과는 <Table 1>과 같다. 붕어고음 농축액의 비율을 15%로 고정하였을 때, 소환은 연자육 분말 55%, 붕어고음 농축액 15% 및 벌꿀 30% 첨가구(C)에서 연자육 분말 50% 첨가구(B)에 비해 색, 풍미 및 조직감은 차이가 없었으나 맛이 보다 더 좋은 것으로 평가되었다. 대환은 경우 연자육 분말 55% 첨가구(C)에 비해 연자육 분말 50% 첨가구(B)에서 맛과 조직감이 보다 높게 평가되었다. 이와 같이 환제의 크기에 따라 제품의 기호도에 차이를 보이는 이유는 소환의 경우 물과 함께 삼켜서 섭취를 하고, 대환의 경우 물 없이 씹어서 섭취하기 때문으로 판단되었다.

붕어고음 농축액 함유 연자육 환제의 일반성분 함량을 분석한 결과는 <Table 2>와 같다.

수분 함량은 소환이 11.09 g/100 g, 대환이 15.59 g/100 g으로 대환에서 유의적으로 많았다. 회분 및 조단백질 함량은 소환에서 유의적으로 많았으며, 탄수화물 함량은 대환에서 유의적으로 높은 함량이었으나, 조지방 함량은 환제의 크기에 따른 유의차가 없었다. 일반성분 함량을 건물량(dry base)으로 환산해 볼 때 회분 및 조단백질의 함량이 소환에서 다소 높았다.

환제의 크기에 따라 회분과 조단백질 함량이 소환에서 더 많았는데, 이는 붕어의 일반성분 함량에서 수분이 78.3%, 회분이 1.9%, 조단백질이 18.1%, 조지방이 2.0%였다는 보고(Sung and Shim, 1981)와 연자육 중 수분이 7.74%, 회분이 4.34%, 조단백질은 20.15%, 조지방은 2.11%, 조섬유 함량이 2.78%였다는 보고(Lee and Byun, 2008)로 미루어 볼 때 연자육의 회분 및 조단백질 함량에 기인된 것으로 생각된다. 연자육 분말이 20% 첨가된 식빵에서 조단백질 함량은 무첨가구에 비해 1.6배 높았다는 결과는 연자육 자체의 조단백질 함량에 의존적이라는 보고도 있다(Lee et al., 2009).

붕어고음 농축액 함유 연자육 환제의 무기물 함량을 분석한 결과는 <Table 3>과 같다. 무기물 총량은 소환이 1,526.2 mg/100 g, 대환이 1,311.2 mg/100 g으로 소환에서 유의적으로 함량이 높았다. 칼륨(K) 함량이 무기물 총량의 51% 수준으로 가장 많았으며, 다음으로 인(P)의 함량이었다. 그 외의 무기물은 총량의 10% 미만의 수준이었으며, 환제의 크기에 따른 유의적인 차이는 보이지 않았다.

붕어찜 통조림 중 무기물 함량은 부원료 첨가비율에 따라 다소간의 차이는 있으나, 대차는 아니었으며, 칼슘 함량이 가장 많았고 다음으로 나트륨, 칼륨, 황 및 인의 순이었다는 보고(Park et al., 2018)가 있는데, 이때 칼슘의 함량은 통조림 제조 시 원료 중에 함유된 뼈에 기인된 것이며, 나트륨의 함량은 첨가된 조미액에서 기인한 것으로 고찰된 바 있다. 본 연구에서 붕어고음 농축액을 첨가한 연자육 환제 중 무기물 함량에서 칼륨의 함량이 가장 많았으며, 다음으로 인의 함량인 것으로 볼 때 상기의 보고와 유사한 것으로 생각된다. 특히 붕어찜의 칼륨 함량이 210.1~211.2 mg/100 g이었다는 보고(Park et al., 2018)로 볼 때 본 연구에서 환제의 칼륨 함량이 676.8~788.8 mg/100 g으로 높았던 것은 붕어고음 제조 시 첨가된 천연식물류 및 연자육 분말의 첨가에 의한 것으로 추정된다.

붕어고음 농축액 함유 연자육 환제의 구성아미노산 함량을 분석한 결과는 <Table 4>와 같다. 총 17종의 아미노산이 동정되었으며, 구성아미노산의 총량은 소환이 10,758.4 mg/100 g, 대환이 8,828.1 mg/100 g으로 소환에서 1.2배 높은 함량이었다. 필수아미노산 함량도 대환에 비해 소환에서 높은 함량이었으나, 총 아미노산에 대한 필수아미노산의 비율은 비슷한 수준이었다. 아미노산의 조성은 총 아미노산에 대해 glutamic acid가 20% 이상이었으며, 다음으로 aspartic acid가 14% 정도로 환제의 크기에 따른 차이는 없었다. 그 외 아미노산은 10% 미만의 비율로 함유된 것으로 나타났다.

붕어는 glutamic acid, aspartic acid, lysine, leucine 등이 총 아미노산의 48.7%에 달하며, 필수아미노산이 총 아미노산의 42.6%로서 쌀의 제1 제한아미노산인 lysine의 함량이 가장 많아 우리나라의 전통적인 식생활에서 영양적 기능이 우수한 단백질 급원으로 이용되고 있다(Sung and Shim, 1981). 더욱이 고온에서 제조된 붕어고음에서 수용성 아미노산은 크게 증가되었으며, lysine은 원료육 대비 90% 이상 유지되어 붕어고음의 제조 시 단백질 함량의 손실이 적었다는 보고가 있다(Ryu et al., 1999). 따라서 붕어고음 농축액을 첨가한 연자육 환제는 크기에 따라 구성아미노산 및 필수아미노산의 함량비율에 대차를 보이지 않아 소환 및 대환의 섭취에 따른 영양적 및 기능적 차이는 없을 것으로 사료된다.

붕어고음 농축액이 함유된 연자육 환제의 물 및 80% 에탄올 추출물에서 총 페놀 및 플라보노이드 함량을 분석한 결과는 <Table 5>와 같다. 물 추출물에 비해 에탄올 추출물에서 총 페놀 및 플라보노이드 함량은 유의적으로 높았다. 총 페놀 함량은 소환이 대환에 비해 유의적으로 높았으며, 플라보노이드 함량은 환제의 크기에 따른 유의적인 차이가 없었다.

연자육을 포함하여 옥죽, 감초, 당귀, 산수유 등 20여종의 약용식물에 대한 총 폴리페놀 함량을 비교한 연구에서 연자육의 총 페놀 함량은 여타의 식물류에 비해 비교적 낮았다는 보고가 있다(Kim et al., 2004). 연자육 분말이 첨가된 절편의 총 페놀 함량은 37.81 mg/g, 플라보노이드 함량은 26.35 mg/g으로 무첨가구에 비해 총 페놀은 3.9배, 플라보노이드 함량은 4.3배 증가되어 연자육 중 총 페놀 및 플라보노이드 함량이 높은 것으로 평가된 보고도 있다(Jeong SH, 2013). 식물체의 종자나 열매에는 비교적 많은 양의 폴리페놀이 함유되어 있는 것으로 알려져 있는데(Cha et al., 1995), 연자의 가공 시 껍질의 유무, 품종 및 건조방법 등에 따라 이들 성분의 함량에는 상당한 차이를 보일 수 있다(Jeong et al., 2012).

전복과 천연 식물류를 혼합하였을 때 총 페놀 함량은 9.21~28.55 mg/100 g의 범위로 식물류의 배합조건에 따라 상당한 차이를 보였으며, DPPH 라디칼 소거활성 및 환원력은 시료 중의 총 페놀 함량에 의존적이며, 혼합물을 구성하는 천연 식물류로부터 유래된 성분 차이 때문이라는 보고가 있다(Shin et al., 2008). 따라서 원료의 혼합비율을 달리한 복합물에서 항산화 활성의 차이는 복합물을 구성하는 특정 재료에 의존적이라는 보고(Cho et al, 2007)와도 일치하는 결과라 생각된다.

연자육의 물 및 80% 에탄올 추출물 중 총 페놀 함량은 각각 15.26 mg/100 g 및 28.04 mg/100 g이었다. 이로 미루어 소환 및 대환의 총 페놀 함량은 연자육에 의존적이라 판단된다. 따라서 붕어고음 농축액에 연자육의 첨가는 붕어고음 자체에 비해 연자육의 기능성을 추가로 확보하는데 도움이 되나, 환제의 크기에 따른 차이는 없는 것으로 여겨진다.

붕어고음 농축액이 함유된 연자육 환제의 물 및 80% 에탄올 추출물에서 DPPH와 ABTS 라디칼 소거활성 및 FRAP에 의한 환원력의 항산화 활성을 측정한 결과는 <Table 6>과 같다. 환제의 물 및 에탄올 추출물은 2~20 mg/mL농도 범위에서 시료의 첨가량이 많아질수록 항산화 활성이 유의적으로 증가되는 경향이었다.

DPPH 라디칼 소거활성은 5~20 mg/mL농도 범위에서 환제의 크기에 관계없이 물 추출물에 비해 에탄올 추출물에서 유의적으로 높은 활성이었다. 환제의 크기에 따른 비교 시, 5~10 mg/mL농도 범위에서 소환이 유의적으로 높은 활성이었다. ABTS 라디칼 소거활성은 소환의 경우 5 mg/mL농도에서, 대환의 경우에는 10 mg/mL농도에서만 물 추출물에 비해 에탄올 추출물에서 유의적으로 활성이 높았다. 환제의 크기에 따른 비교 시에도 물 추출물에서는 10 mg/mL농도, 에탄올 추출물에서는 20 mg/mL농도에서만 대환에 비해 소환에서 유의적으로 높은 활성이었다. 환원력은 환제의 크기에 관계없이 모든 농도에서 물 추출물에 비해 에탄올 추출물의 활성이 유의적으로 높았으며, 소환에서 유의적으로 높은 환원력을 보였다.

DPPH 및 ABTS 라디칼에 대한 50%의 소거를 발휘하는 시료의 농도와 환원력에 대한 표준물질로써 FeSO₄·7H₂O의 100 μM에 해당되는 시료의 농도로 산출한 EC_value는 물 추출물보다 에탄올 추출물에서 유의적으로 낮았으며, 대환에 비해 소환에서 유의적으로 낮아 전반적으로 대환에 비해 소환의 항산화 활성이 높은 것으로 평가되었다.

연자육 에탄올 추출물은 100 μg/mL 농도에서 70% 이상의 DPPH 라디칼 소거활성을 보였는데, 이러한 이유는 시료 중의 총 페놀 함량이 96.75 μg tannic acid/mL였다고 보고되어 있으며(Park et al., 2006), 또한 연자육의 ethylacetate 분획물과 열수 추출물의 200 μg/mL농도에서 DPPH 소거활성이 각각 96.54%, 21.25%로 차이를 보인 이유도 각 시료 중의 페놀성 화합물의 함량 차이 때문이라고 보고되어 있다(Park et al., 2010). 따라서 본 연구에서 붕어고음 농축액 함유 연자육 환제 중 소환이 대환에 비해 항산화 활성이 유의적으로 높았던 것도 상기의 보고와 마찬가지로 소환에서 총 페놀 함량이 유의적으로 많았기 때문이라고 판단된다.

골손실 동물모델을 이용한 조골세포 증식에 대한 한방 경옥고, 연자육 분말이 첨가된 경옥고 및 연자육 추출물의 활성 비교에서 연자육이 첨가된 경옥고의 활성이 가장 우수하여 경옥고에 연자육이 첨가되었을 때, 연자육은 경옥고 자체의 효능 이외에 부가적인 기능성 증대에 도움이 되는 것으로 고찰된 보고가 있다(Kim et al., 2011). 와송에 3종의 천연식물류 추출물이 첨가된 혼합물과 와송 단일 추출물과의 항산화 활성을 비교한 결과에서 혼합물은 와송 단일 추출물에 비해 항산화 활성이 높았으며, 이러한 결과는 혼합물 중에 총 페놀 및 플라보노이드 함량이 많았기 때문이라고 보고되어 있다(Lee et al., 2012). 더욱이 폴리페놀 화합물 함량이 많은 물질의 섭취는 체내 지질과산화물 생성저해와 산화적 스트레스 완화에 더 효과적이라는 보고도 있다(Kwon et al., 2002).

따라서 붕어고음 농축액이 함유된 연자육 환제의 개발은 붕어고음 또는 연자육 단일 제품에 비해 항산화 활성을 증대시키는데 효과적인 것으로 사료된다.