Journal Archive

실험에 사용된 조피볼락은 지역양식장에서 생산된 미성어(평균전장: 15.8 ± 1.9 cm, 평균체중: 68.1 ± 26.7 g)를 구입하여 연구실의 사육시설에서 일주일간 순치시켰고, 건강상태를 확인하기 위해 세균검사를 실시하였다. 소음 자극실험은 순환여과방식으로 수온이 21℃로 유지되는 폭 1.0 m, 높이 1.2 m의 원통형 수조에서 수행하였으며, 대조구와 실험구의 수조는 서로 독립적인 공간에 설치하여 수조 당 40마리씩 실험어를 수용하였다. 수중소음 출력은 해상풍력단지의 항타 작업 시 발생하는 소음의 주파수 대역을 증폭시켜 거리 감쇠를 고려한 뒤 음압이 조절되는 디지털 음원으로 제작하였고, 대조구 및 네 개의 실험구로 나누어 14일간 실험을 진행하였다. 이때 실험구의 소음기준은 2009년 중앙환경분쟁조정위원회에서 육상양식장을 대상으로 제시한 소음피해 인정기준치인 140 dB/µPa를 포함하는 125, 135, 145, 155 dB/µPa를 실험구로 설정해 연구를 수행하였다. 실험과정 시 발생하는 소음은 Hydrophone type 8105와 8106으로 측정하였고, 측정값을 실시간으로 모니터링하며 소음 출력을 조절하였다. 실험기간 동안 사료 급이는 하루에 1회 실시 하였으며, 이때 사용한 사료는 양식장에서 출하 시 사용하던 사료와 동일한 제품을 구입하여 이용하였다.

수중소음 스트레스에 대한 영향을 평가하기 위해 소음자극 후 1, 3시간, 3, 7, 14일 째 무작위로 3마리씩 선별하였고, benzocaine (Sigma-Aldrich, USA)을 이용하여 안락사 시킨 뒤 샘플링을 진행하였다. 채혈은 1 ml 주사기를 이용하여 미부정맥을 통해 수행하였고, 상온에서 1시간, 4℃에서 24시간 동안 반응시킨 뒤 4,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 또한 채혈이 완료된 검체에서 즉시 신장조직을 무균적으로 적출하였고, 실험에 사용하기 전까지 –80℃에서 보관하였다.

소음 스트레스에 의한 조피볼락 내 영향을 분자생물학적 분석으로 확인하기 위해 (주)지노믹트리에 의뢰하여 microarray chip 제작과 분석을 수행 하였으며, chip은 총 380가지의 DNA clone들을 Ultra GAPS2 slide (Corning Inc., USA)에 spotting하여 제작하였다. 유전자 발현분석을 위해 준비한 신장 샘플들은 TRIzol (Invitrogen, USA)을 이용하여 total RNA를 분리하였으며, Cy3 및 Cy5 monofunctional reactive dyes (GE Healthcare, UK)와 역전사(reverse transcription, RT)-PCR을 이용하여 표지한 후 제작한 chip과 hybridization하여 Genepix Pro 6.0 analysis software (Foster City, USA)를 통해 hybridization signal을 분석하였다. 유전자 발현분석 결과는 시각화를 위해 R studio version 4.1 (RStudio, PBC)을 이용해 heat map을 작성하였다.

분리한 혈청은 생화학분석기인 DRI-CHEM 4000i (Fujifilm, Japan)를 이용하여 albumin (ALB), glucose (GLU), glutamic oxalacetic transaminase (GOT), glutamic pyruvate transaminase (GPT), total cholesterol (TCHO)의 5가지 항목을 측정하였고, 혈중cortisol 농도는 Cortisol EIA Kit (Oxford Biomediacl Research, USA)와 Victor 3 microplate reader (Perkin Elmer, USA)를 이용하여 Hur et al.,(2006)의 방법에 따라 수행하였다.

스트레스에 의한 혈청 내 비특이적 면역기능에 대한 영향을 확인하기 위해 대표적인 어병세균인 Streptococcus iniae FP5228을 이용하여 살균능을 확인하였다. S. iniae는 brain heart infusion (BHI) 액체 배지에 배양한 후 PBS 세척하였으며, 540 nm에서 흡광도를 측정하여 0.6이 되도록 PBS로 희석한 후 혈청과 1:1로 혼합하였고, 1시간 30분 동안 실온에서 반응시켰다. 그 후 단계별로 희석하여 BHI 평판배지에 도말하였고, 27℃에서 24시간 동안 배양한 뒤 세균의 집락수를 계수하였다.

소음 노출 후 세균성 질병에 대한 감수성 변화를 확인하기 위해 14일 간 소음에 노출된 실험어를 실험구당 20마리씩 무작위로 선별한 뒤 S. iniae를 5 × 10⁶ CFU/mL의 농도로 PBS에 희석하여 100 µL씩 복강 주사하였고, 인위감염 후 21℃에서 10일간 절식시키며 누적폐사율을 관찰하였다.

실험결과에서 샘플 및 그룹 간 유의성을 평가하기 위해 SPSS 19.0 프로그램(IBM, USA)을 이용하여 one-way ANOVA와 Duncan's multiple test로 분석하였으며, *P < 0.05 수준에서 유의적인 차이를 검정하였다.

소음 음압 레벨별 자극시간 경과에 따른 유전자발현 변화를 분석한 결과 380개의 분석대상 유전자 중 각각 53개(125 dB/µPa), 80개(135 dB/µPa), 49개(145 dB/µPa), 56개(155 dB/µPa)의 유전자에서 유의적인 발현변화가 확인되었고, 이 중 공통적으로 확인된 41개 유전자의 발현변화는 heat map으로 나타내었다([Fig. 1]). 결과적으로 스트레스 반응 및 면역관련 유전자들은 대부분 자극 시간이 경과될수록 발현이 증가하여 14일째 가장 높은 수준으로 발현했고, 특히 내이발달 및 유모세포와 연결된 청각신경의 형성을 유도하는 MAF BZIP transcription factor B와 유모세포의 손상을 보호하는 heat shock protein 70 유전자의 발현 또한 14일째 가장 많이 발현되었다(Cordes and Barsh, 1994; Konings et al., 2008; Yu et al., 2013).

[Fig. 1] 
Heat map showing the expression levels of 41 genes with patterns according to sound pressure after noise stimulation. The calculated log2 fold change compared to the control sample; red indicates up-regulated expression, and blue indicates down-regulated expression.

소음은 어류에서 내분비계 스트레스 반응을 유발시키며, 항상성유지를 위해 다양한 생리적인 적응기전이나 보상작용이 발생하지만 스트레스가 심각하거나 오래 지속될 경우 성장, 면역기능, 생식, 행동의 변화가 초래될 수 있고, 반면 약한 스트레스에 지속적으로 노출되면 신경내분비 및 대사반응을 약화시킬 수도 있다(Sverdrup et al., 1994; Reid et al., 1998; Santulli et al., 1999). 우리는 소음 스트레스에 대한 어류 내 내분비계 변화를 확인하기 위해 6가지의 관련 항목(ALB, GLU, GOT, GPT, TCHO, cortisol)을 측정하였다(<Table 1>). 먼저 조피볼락 혈청 내 ALB의 수치는 135 dB/µPa의 소음노출 3시간과 7일 경과 후 대조구에 비해 유의적인 증가를 보였지만, 3일째에는 유의적인 감소가 나타났다. 포유류에서 혈청 내 ALB의 수치는 염증, 쇼크, 영양부족 등의 지표로 알려져 있으며, 어류에서도 소음 스트레스 관련 지표로 입증되었다. Shim and Han(2008)의 연구에서 조피볼락은 212 dB/µPa의 강력한 소음으로 12시간 동안 노출된 결과 ALB 농도는 유의적인 변화가 관찰되지 않은 반면 장어는 212 dB/µPa의 소음에 의해 1시간 내 유의적으로 감소되었다(Shim and Han, 2008; Park et al., 2011). 또 다른 대표적인 스트레스 지표인 GLU의 농도는 대조구에 비해 높게 측정되었지만 개체별 차이로 인해 유의적인 차이는 확인되지 않았다. 이전의 연구에서 장어의 GLU는 30분 만에 유의적으로 발현이 증가하였고, 조피볼락에서도 소음 스트레스를 가한 직후부터 유의적인 증가가 나타났다(Shim and Han, 2008; Park et al., 2011). GPT와 GOT효소는 간 건강의 대표적인 지표로써 이들의 혈액 내 증가는 간의 괴사, 조직변성, 단백질 대사변화 등을 예측할 수 있다(Bruslé and Anadon, 1996). 이번 연구에서 GPT 수치는 유의적인 변화가 관찰되지 않았지만 GOT는 135 dB/µPa의 소음에 노출 후 3시간째 유의적으로 증가한 이후 대조구 수준으로 회복되었다. TCHO 수치는 노출 7일째 145 dB/µPa와 155 dB/µPa 그룹에서 일시적으로 유의적인 감소를 보였지만 7일 후 측정결과에서는 다시 회복되었고, 실험어의 전장 및 체중 변화 또한 실험이 종료된 14일차에 유의적인 변화가 나타나지 않았기 때문에 결과적으로 소음 스트레스가 조피볼락의 사료 섭이, 영양상태, 성장에는 영향을 미치지 않을 것으로 생각된다.

어류의 3단계 스트레스 반응 중 첫 번째 반응은 시상하부-뇌하수체-신장 축의 활성에 따라 cortisol 호르몬의 분비량이 증가되는 것이며, 스트레스로 과다 분비된 cortisol은 성장 및 번식의 억제, 배아발달 방해 등 어류에 부정적인 영향을 유발할 수 있다(Sturmhofel and Bartke, 1998; Schreck et al., 2001; Nesan and Vijayan, 2012). 또한 면역체계는 신경내분비계와 밀접하게 연결되어있어 경골어류의 면역 반응을 조절하는데, 증가된 cortisol은 사이토카인의 생성을 억제시켜 세포성 면역반응의 저하를 유도할 수도 있다(Holland et al., 2003; Saeij et al., 2003; Castillo et al., 2009). 일반적으로 안정적인 상태의 어류 체내 cortisol 농도는 5 ng/mL 이하로 측정된다고 보고되어 있으며, 우리의 연구에서도 대조구의 cortisol 농도는 위와 유사한 수준으로 측정되었다(Pickering and Pottinger, 1989). 그러나 소음 자극 후 1시간째 모든 실험구에서는 혈청 내 corisol 농도가 상승했고, 특히 135 dB/µPa와 145 dB/µPa의 실험구에서 유의적인 증가가 나타났다. 이후 3시간째 측정에서는 corisol 농도가 감소했으며, 특히 135 dB/µPa와 155 dB/µPa의 소음 구간에서 유의적인 감소가 나타났다([Fig. 2]).

[Fig. 2] 
Changes in serum cortisol levels of Korean rockfish according to exposure time to noise stress. Data are presented as means ± S.D. for three fish. Significant differences were noted at *P < 0.05 when compared to the control group.

이전의 연구에서 212 dB/µPa의 강한 소음에 의해 장어와 조피볼락 내 corisol 농도는 GLU와 함께 자극 직후부터 유의적인 발현 증가가 나타났고(Shim and Han, 2008; Park et al., 2011), 우리의 연구에서도 GLU 수치는 자극 1시간째 비교적 가장 높게 상승했다. 결과적으로 혈청학적 분석결과에서는 개체간의 차이로 인해 일부 측정 결과에서 통계적인 유의성이 나타나지 않았지만 스트레스 관련 지표인 GLU와 cortisol의 발현이 초기에 상승했고, 이후에는 지속적인 소음 스트레스에 대한 적응으로 인해 대조구 수준으로 수치들이 안정화된 것으로 생각된다.

혈청의 살균활성 평가결과에서는 소음자극에 의해 1시간째 125 dB/µPa와 155 dB/µPa 그룹에서 살균능이 유의적으로 감소하였으며, 3시간째에는 155 dB/µPa 그룹에서 유의적인 증가가 나타난 뒤 3일째에는 125 dB/µPa을 제외한 모든 그룹에서 유의적으로 감소했다([Fig. 3]). 이후 7일째에는 125 dB/µPa와 135 dB/µPa 그룹에서 유의적인 증가와 155 dB/µPa 그룹에 감소가 나타났으며, 14일째에는 모든 실험구의 살균능이 유의적으로 증가하였다. 결과적으로 소음 스트레스에 의해 모든 실험구에서 혈청 항균능이 일시적으로 감소했으며, 특히 고음압 실험구인 145 dB/µPa와 155 dB/µPa에서 더욱 저하된 항균능을 확인할 수 있었다. 그러나 자극 14일째 모든 실험구에서 높은 항균활성이 나타났으며, 이러한 결과는 [Fig. 1]에서 확인된 스트레스 관련유전자 및 단백질 가수분해효소 관련 유전자의 발현 증가가 혈청 내 항균활성 인자로써 작용했거나 일시적으로 발생한 보상메커니즘으로 판단된다(Basu et al., 2002; Johnson and Pellecchi, 2006; Kim et al., 2009; Zhang et al., 2020).

[Fig. 3] 
Serum antibacterial activity against Streptococcus iniae after noise exposure. Data are presented as means ± S.D. for three fish. The difference in the survival rate between the control group and the treatment group was statistically significant at *P < 0.05.

소음 스트레스에 의한 직접적인 면역학적 영향을 확인하기 위해 수행한 인위감염 실험에서는 S. iniae 감염에 의해 고음압 실험구인 155 dB/µPa에서 감염 1일째부터 가장 급격한 폐사가 일어났고, 나머지 실험구에서도 10일째 90%이상의 폐사율이 나타났다([Fig. 4]).

[Fig. 4] 
The cumulative mortality rate for 10 days in Korean rockfish artificially infected with Streptococcus iniae after 14 days of noise exposure.

반면 대조구에서는 감염 8일째까지 폐사가 나타나지 않았고, 마지막 10일째 총 20%의 폐사율을 기록했다. 이전 연구결과 소음 스트레스는 지속시간과 강도에 따라 다른 면역반응을 유도했고, 경골어류에서도 장시간의 소음 노출은 숙주의 면역력 감소와 질병 발생에 대한 감수성 증가로 나타났다(McCarthy et al., 1992; Pascuan et al., 2014; Madakkannu and Ravichandran, 2017; Masud et al., 2020). 이러한 결과들은 풍력발전소 건설 시 발생하는 소음이 조피볼락의 면역체계에 부정적인 영향을 미칠 수 있음을 의미하며, 소음관리기준인 140 dB/µPa 이하의 음압에도 지속적인 노출에 의해 면역체계가 손상되어 질병유행 시 치명적인 대량폐사가 발생할 수 있음을 시사한다.