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본 시험에 사용된 반응기는 외경이 36.9cm, 내경 30.9cm, 높이 67.4cm인 Steel Use Stainless(SUS 316 L)로 된 원통형 50 L 형태로 제작되었다. 내경에 장착할 임펠러는 6개의 날개가 있는 터빈형 (Turbine Impeller)과 패들형(Paddle Impeller)을 이용하였다. 터빈임펠러와 패들임팰러의 경우 지름이 15.5cm이고 높이가 10cm로 반응기 내경의 50.1%이었으며, 하층 임펠러와 바닥 사이의 거리는 15cm로 하였다. 통기 장치는 Microsparger (Mott corporation)로 통기 구멍 크기가 24um로 직경은 외경 2mm, 내경 1.5mm, 길이 10cm를 사용하였다. 제작된 배양기에 Do Probe(Broadley James, USA)를 부착하고, probe로부터 출력되는 신호의 데이터는 컴퓨터를 이용하여 1분 단위로 자동적으로 저장되도록 하였다. 컴퓨터에 전달된 전압 값은 계산식에 의해 용존 산소농도(%)로 환산되어 화면상에 표시되었다. 산소전달계수 (Kla)를 구하기 위해, 일반적으로 많이 쓰이고 있는 Dynamic method를 이용하였다.

강력한 항균활성을 가진 균주로 선발된 Bacillus sp. 2-4(KCCM11107P)는 국립수산과학원을 통해 기술이전 받아 산업배지를 이용에 따른 대량배양을 통한 산업화 가능성을 확인하기 위해 사용하였다. 균주 보관용 배지는 tryptic soy agar (TSA, Difco) 배지를 사용하여 30℃에 48시간 조건으로 배양한 후, 국립수산과학원에서 제시한 방법에 따라 유기용매인 아틸아세테이트(ethyl acetate)를 이용하여 추출을 진행하였다(Kim et al., 2017).

산업배지 조성선정을 위해 Bacillus sp. 2-4 배양액의 균밀도(bacterial density)는 분광광도계 (660 nm)를 이용하였고, 배양액의 항균활성은 paper disk법을 이용하여 비교하였다. 확보한 용매추출물의 항균활성 스펙트럼을 조사하기 위해 어류질병을 일으키는 병원성 세균 3종(Edwardsiella tarda, Vibiro anguillarum Streptococcus parauberis)에 대한 항균활성을 다음과 같은 방법을 통해 검사하였다. 먼저 각각의 세균들을 BHIB(Difco, USA)배지에 배양한 후, 1.0 x 10⁸ cfu/ml의 농도를 MHA(Difco, USA)에 도말하였다. 이어서 직경 0.8cm의 paper disk를 올린 다음, Bacillus sp. 2-4 배양액을 50uL를 첨가하여 투명환의 크기를 측정하여 비교하였다.

Bacillus sp. 2-4가 배지내로 생산하는 항균물질을 확인하기 위한 이차대사산물분석은 질량분석기(LC-MS/MS)를 사용하여 진행하였으며, 생성량의 변화를 관찰하기 위해 HPLC 분석을 통해 물질을 분석하였다. 상기 분석장비 및 조건은 국립수산과학원에서 제시한 내용과 동일한 방법으로 진행하였다(Kim et al., 2017).

기본배지에서 나머지 영양분의 변화를 주지 않고, 탄소원만 변화를 주어 Bacillus sp. 2-4 균주의 배양 과정에서 탄소원의 영향을 조사하였다. 모든 탄소원(sucrose, mannitol, fructose, glucose, casein, hydrolysate, glycine, cystein, CaCO₃, 효모 추출액, tryptone)은 기본 배지의 탄소량과 같은 0.5%를 첨가하였으며, 30℃, 100 ppm의 조건으로 48시간 배양하여 균밀도와 항균능력을 관찰하였다.

기본배지에서 나머지 영양분의 변화를 주지 않고, 질소원(soybean meal, yeast extract, casein peptone, corn steep liquor, malt extract, ammonium sulfate, ammonium nitrate, sodium nitrate, potassium nitrate)만 변화를 주어 Bacillus sp. 2-4의 배양과정에서 질소원의 영향을 조사하였다.

Bacillus sp. 2-4균주의 대량배양을 위한 배양 적온 및 적정 배양 시간을 조사하기 위하여 멸균된 15L 배지가 포함된 30L Jar 발효기에 Bacillus sp. 2-4 균주 0.5%를 접종한 후 20℃, 25℃, 30℃, 35℃ 및 40℃ 온도의 조건에서 배양하였다.

산업배지의 초기 pH는 종균의 산업배지에서의 초기 배양속도를 결정하는 중요한 요소이므로 배양을 위한 최적 pH를 선정하기 위해 산업배지로 멸균 후 20% NaOH을 이용하여 종균 접종전의 초기 pH를 pH 5 ~ pH 9로 조절하였고 배양 48시간 경과 후 균밀도 및 항균활성을 분석하였다.

배양 시 최적 공기 주입량을 확인하기 위하여 공기 주입량을 0.1 ~ 2.0 vvm으로 조절하여 처리하였고 배양 48시간 경과 후 균밀도 및 항균활성을 분석하였다.

교반속도에 따른 Bacillus sp. 2-4균주의 균밀도 및 항균능력의 영향을 관찰하기 위해 교반속도를 50, 100, 150, 200 및 250 rpm으로 각각 조절하여 48시간 동안 배양 후 균밀도 및 항균능력을 조사하였다.

확립된 산업배지 조성 및 최적배양조건을 바탕으로 Bacillus sp. 2-4균주의 파일럿 플랜트(2KL)의 생산 프로세스를 확립하였다. 먼저 스케일업 (scale-up) 단계는 Bacillus sp. 2-4 앰플 → 50 ml → 10 L → 2 KL의 단계로 진행되었고 각 단계별 접종량은 0.5%로 설정하였다. 단계별 배양 조건 및 배양 시간은 <Table 1>에 표기하였다.

2 KL scale의 파일럿 플랜트를 기반으로 산업적으로 생산단가 감소 및 활성물질의 증가를 위한 20 KL의 대량배양 공정체계에 적용하였다.

어류질병을 일으키는 병원성 세균 3종에 대한 항균활성을 측정한 결과, E. tarda 32mm, V. anguillarum 15mm, S. parauberis 35mm의 클린존이 관찰되었다(<Table 2>).

Strains	Diameter of inhibition zone (mm)
E. tarda	32
V. anguillarum	15
S. parauberis	35

탄소원 실험결과, casein hydrolysate를 처리하였을 때, 생균수의 양이 가장 많은 것으로 나타났으며 glucose를 처리 시 항균능력이 가장 높은 것으로 관찰되었다([Fig. 1]). 또한, 질소원의 경우 yeast extract와 soybe an meal에서 균밀도와 항균력이 가장 높은 것으로 확인되었다([Fig. 2]). 본 결과를 통해 탄소원은 casein hydrolysate 및 glucose 질소원은 yeast extract 및 soybean meal로 선정하였다.

[Fig. 1] 
Effects of various carbon sources on antifungal activity of Bacillus 2-4 (KCCM11107P).

[Fig. 2] 
Effects of various nitrogen sources on antifungal activity of Bacillus 2-4 (KCCM11107P).

탄소원과 질소원의 농도에 따른 균밀도 및 항균능력을 조사하였다. 기본배지에 탄소원, 질소원, 무기염의 농도를 고정한 상태에서 상기 탄소원(casein hydrolysate 및 glucose)과 질소원(yeast extract 및 soybean meal)을 각각 0~4% 사이의 농도로 탄소원은 3:1, 질소원은 1:5로 혼합하여 처리한 결과, 총 탄소원은 2.0%, 질소원은 3.0%를 함유하였을 때 균밀도의 농도가 가장 높았으며, 가장 강력한 항균능력을 나타내었다 [Fig. 3 & 4]. 또한 상기 결과를 바탕으로 Bacillus sp. 2-4의 최적 산업배지 조성을 확립하였다(<Table 23>).

[Fig. 3] 
Investigation on the bacterial density based on concentrations of carbon source and the antibacterial activity.

[Fig. 4] 
Investigation on the bacterial density based on concentrations of nitrogen source and the antibacterial activity.

대량배양을 위한 온도 및 pH에 따른 배양 효율 분석 결과, 균밀도는 30℃, 35℃에서 배양 시 가장 높게 나타났으며, 항균능력은 30℃에서 높게 나타나 배양적온을 30℃로 선정하였다([Fig. 5]). pH 결과, pH 6~8사이에서 균주의 균밀도 및 항균능력이 뛰어난 것으로 확인되었으며, 특히 pH 7에서 가장 높은 항균능력이 관찰되어 적정 ph를 7로 선정하였다([Fig.6]).

[Fig. 5] 
Investigation of proper temperature for culture.

[Fig. 6] 
Investigation of proper pH for culture.

배양 시 최적 공기 주입량을 확인한 결과, 공기 주입량 1.5 vvm까지 공기 주입량이 많을수록 증가하였지만, 0.5 vvm일 때, 항균능력이 가장 높았으나, 공기 주입량이 많을수록 항균 능력이 저하되는 것을 확인하였다([Fig. 7]).

[Fig. 7] 
Investigation of proper air for culture.

교반속도에 따른 균밀도 및 항균능력을 관찰한 결과, 교반속도가 증가할수록 균밀도가 높아지는 것으로 나타났으며, 100 rpm을 기점으로 교반속도가 증가할수록 항균능력이 저하되는 것으로 확인되었다.

[Fig. 8] 
Investigation of proper churn speed for culture.

파일럿 플랜트 (2 KL)의 생산 프로세스 확립 후 배양 및 생산을 진행한 결과, 배지 내 탄소원과 용존산소량의 변화는 배양 6시간 이후 급격하게 나타났고, 항균물질 중 8시간 때 조바실로 마이신(crude bacillomycin), 11시간 이후 조서펙틴 (crude surfactin)이 발생하기 시작하였으나, 배양 16시간 이후부터는 항균물질의 함량에 변화가 없는 것으로 나타났다([Fig. 9]).

[Fig. 9] 
Checking production of substances due to culture production of 2 KL

해양 유래 미생물 Bacillus sp. 2-4 균주의 대량 배양 공정 체계 (20KL)의 배양적 특성 및 배양 후 공정은 <Table 4>에 나타내었으며, 20 KL의 대량배양 공정체계에 적용한 결과, 조바실로 마이신 및 조서펙틴이 생성되는 것을 확인하였으며, 이를 통해 균밀도 및 항균물질 생산량의 체계를 확립하였다([Fig. 10]).

[Fig. 10] 
Checking production of substances due to culture production of 20 KL