육상 사육 황복(Takifugu obscurus)친어의 Vibrio harveyi감염증

Ⅰ. 서 론

황복(Takifugu obscurus)은 복어목, 참복과의 어류로서, 우리나라 서남해와 동중국해에 분포한다. 4-6월의 산란기의 야간에 하천의 중상류로 올라와 바닥이 자갈인 곳에 산란 부화하고, 성장함에 따라 바다로 이동하는 성장하는 광염성의 소하성 어종(anadromous species)이다(Jung, 1977). 하천의 오염, 산란을 위하여 소상하는 친어의 남획 및 하구의 인공 구조물의 축조에 의한 산란장의 감소 등으로 인하여 자원량 급감하여, 거의 멸종 위기에 도달한 어종이었다. 그러나 인공종자생산기술이 발달되면서 (Jang et al., 1996), 기존의 뱀장어 양식장 또는 넙치 양식장 등의 유휴 양식장을 활용하여, 육상 수조식 또는 축제식 방식으로 경기와 충남, 전남 등에서 주로 양식되고 있는 어종이다. 황복 양식은 광염성인 특성을 이용하여 침체된 내수면 양식의 새로운 대상종으로 주목받고 있다. 최근 양식 기술이 발달함에 따라 수컷 자주복과 암컷 황복을 교배시켜, 외형은 황복과 차이가 없지만, 성장은 자주복의 성장에 비할 만큼 빠른 교잡종을 주로 양식하고 있다(Sung, 2014).

황복은 양식의 역사가 짧고 또한 양식 규모도 크지 않기 때문에 질병에 관한 연구는 Aeromons sobria (Bang, 2001), V. harveyi (Won et al., 2009)의 세균성 질병, 요각류 (Choi et al., 1998), 담수산 백점충 (방, 2001) 및 해산 백점충 (Park et al., 2004)의 기생성 질병, 진균성 질병인 Mucor sp. (Yang et al., 2008) 및 종자 생산기에 발생하는 척추만곡증 ((Park et al., 2007) 등 극히 일부에 불과하다.

그람 음성 간균인 Vibrio는 해양의 상재 세균으로서 염분이 있는 해양 환경에 넓게 분포되어 있다(Huq and Colwell, 1995). Vibrio harveyi는 분류학상으로, Achromobacter harveyi 분류되었지만, Vibrionales, vibrionaceae로 되었다. 또한 Vibrio carchariae와 V. harveyi를 다르게 분류했었지만, 분자생물학적 기법을 사용하여 현재에는 동일 종 임이 입증되었다.(Gauger et al., 2002).

V. harveyi는 다양한 해산 양식 척추 또는 무척추동물에 감염되는 병원체로서 (Austin and Zhang, 2006), 해산어류에는 조건성 병원체로 작용한다. V. harveyi는 눈볼개 Centropomus unidecimalis (Kraxberger-Beatty et al., 1990), 귀족도미 Sparus aurata (Balebona et al., 1995), silvery black porgy Acanthopargrus cuvieri (Saeed, 1995), 흉상어 Carcharhinus plumbeus (Beatty et al.., 1996), 유럽황돔 Dentex dentex (Company et al., 1999), 여름넙치 Paralichthys dentatus (Soffientino et al., 1999), 큰입선농어 Lates calcarifer (Tendencia, 2002; Ransangan and Mustafa, 2009; Dong et al., 2017), 홍민어 Sciaenops ocellatus (Liu et al., 2003), 날새기 Rachycentron canadum (Liu et al., 2004), 세네갈 서대 Solea senegalensis (Rico et al., 2008; Haldar et al., 2010), 쐐기서대 Dicologoglossa cuneata (Lopez et al., 2009), 자주복 Takifugu rubripes (Mohi, 2010), 넙치 Paralichthys olivaceus (Li et al., 2011), 소할탱 (Acanthurus sohal) (Hashem and El-barbary, 2013), 맹그로브 도미 Lutjanus argentimaculatus (Krupesha et al., 2014), 잿방어 Seriola dumerrili (Minami et al., 2016) 등의 어류에 감염되어 발병되는 것으로 보고되었다.

본 연구에서는 체표 궤양 증상을 나타내는 양식 황복의 V. harveyi 감염에 따른 증상과 원인균의 특성, 병원성 및 병리조직학적인 변화를 조사하여 보고한다.

Ⅱ. 재료 및 방법

Ⅲ. 결과 및 고찰

1. 발병 상황 및 증상

병어는 수온 24℃의 여과해수를 사용하여 실내 콘크리트 수조에서 유수식으로 사육하고 있었다. 먹이는 시판의 넙치 육성용 배합사료(조단백 52%이상, 조지방 10%이상)를 어체중의 3%를 1일 분량으로 하여 매일 3회씩 나누어 투여하고 있었다. 사육 중인 개체 총 20마리 중에서 5마리는 폐사하고, 남아 있는 개체는 먹이를 섭취하지 않아 상당히 여윈 상태였다. 문진으로 확인한 결과 질병이 발생한 친어는 당년도의 봄철에 일부의 개체에 두부에 피부 궤양이 형성된 집단으로, 수온이 올라가면서 자연적으로 증상이 치유된 집단이었다. 그러나 여름철의 고수온기를 지나 수온이 다시 25℃로 이하로 내려가면서 이러한 증상이 재발 된 것으로, 양식 어민은 이러한 현상이 양식 현장에서 여러 번 발생하였다고 하였다.

병어는 쇠약한 상태이지만, 체색은 정상이었다. 병어는 두 눈 사이의 두개골 부분에 직경 34 ㎜의 1개의 커다란 얕은 궤양과 우측 아가미 뚜껑에 직경 15 mm의 원형의 궤양이 형성되어 있는 것이 특징이다. 일부의 개체에서는 배쪽 피부에 궤양이 형성되어 내장기관이 노출된 개체도 존재하였으며, 1개체는 가슴지느러미, 꼬리지느러미와 배지느러미의 끝부분이 발적 및 결손 되어있었다.

내부 증상은 간장의 퇴색과 간장의 표면에 미소한 갈색의 반점이 형성된 것을 제외하고는 이렇다 할 증상은 발견할 수 없었다([Fig. 1]참조).

[Fig. 1]

Symptoms of diseased river puffer. A: skin ulcers on the head and the operculum, and redness on the distal part of pectoral fin. B: pale river with some brownish small spots like ceroid.

병어의 말초혈액의 도말표본을 May-Grűnwald Giemsa 염색하여 관찰하면 단구의 수가 현저히 증가 되어있어, 질병이 만성적으로 진행되었음을 알 수 있었다([Fig. 2]-A참조). 또한 Ht치는 대조군과 병어 모두 17-18의 범위로 서로 차이가 없었다. Hb은 병어는 4.93 (4.89~4.97)이었으며, 대조군은 4.49 (4.47~4.51)로 차이가 없었다.

[Fig. 2]

A: Smear preparation of peripheral blood stained with May-Grűnwald Giemsa. B: Gram negative rod isolated from the skin ulcer on TCBS-2.

2. 원인균의 분리 및 동정

병어의 피부 환부, 간장, 신장 및 비장의 도말표본에서는 그람 음성의 간균이 관찰되었다. 발견되는 세균의 숫자는 피부 환부가 많은 반면, 내장기관에서는 자세히 관찰하지 않으면 발견의 곤란할 정도로 소수에 불과하였다.

원인균의 분리를 위해 병어의 피부 궤양 환부와 신장, 비장 및 간장을 TSA-2배양하였을 때는 직경 1.7 mm정도의 광택이 있는 중앙부 엷은 황색으로 융기되는 원형집락이 발육하였다. 또 TCBS-2에서는 직경 2 mm의 황색의 원형 집락이 형성되었다([Fig. 3]참조). 또한 내장기관을 2종의 한천배지에 배양하여 발육한 집락도 피부 궤양을 접종한 후에 발육한 집락과 형태적으로 동일하였지만, 발육한 집락의 숫자는 피부 궤양에 비해 소수에 불과하였다.

[Fig. 3]

Colonies of the present isolate (MC9029SU) on TSA-2 (A) and TCBS-2 (B) 24 hrs after incubation at 25℃.

발육한 균을 Gram염색한 다음 광학현미경으로 관찰하면 그람 음성의 간균임이 확인되었다(Fig 2-B). 본 실험에서는 TCBS-2에서 발육한 균을 순수 분리한 다음 피부 궤양 유래의 균주를 MC9029SU, 신장 유래의 균주를 MC9029K로 명명하여 이하의 실험에 사용하였다.

분리균은 <Table 1>에 표시한 것처럼 Gram음성, 운동성 양성, oxidase양성, Catalase 양성, H₂S 음성, 0/129에 대한 감수성 양성, 포도당을 분해하여 산을 생성하지만 가스 생산 못하고 TCBS 노란색으로 자라므로 Vibrio에 속하는 것으로 나타났다(Rasheed, 1989). 분리균들(MC9029SU, MC9029K)은 표준 균주(ATCC 14126)는 다르게 luminous에서 음성을 보였다. 1% peptone수를 기초배지로 발육에 미치는 염분과 온도의 영향을 표준균주 ATCC 14126과 비교하여 조사한 결과 2~4%의 염분에서 발육하였으며, 발육 가능 온도는 20~35℃, 발육 최적온도는 30℃ 였다([Fig. 4]참조).

<Table 1>

Biochemical and physiological characteristics of the isolates and the reference strains by conventional microbiological tests

[Fig. 4]

Growth of V. harveyi isolates at different temperatures and NaCl(%).

API 20NE를 사용한 생화학특성 조사의 결과는 <Table 2>에 표시한 것처럼 NO₃(Potassium nitrate), TRP(L-tryptophane), GLU(D-glucose), ESC(Esculin ferric citrate), GEL(Gelatine), PNPG(P-nitrophenyl-ß-D-galactopyranoside), GLU(D-glucose), NBE(D-mannose), MAN(D-mannitol), MAL(D-maltose), GNT(Potassium gluconate), MLT(Malate), CIT(Citrate)는 양성, ADH(L-arginine), CAP(Caprate), PAC(Phenylacetyic acid) 음성으로 서로 같게 나왔다. 반면에 표준균주와 차이점은 ATCC 14126과는 URE(urea) 양성, ARA(L-arabinose) 음성이었고, ATCC 35084와는 NAG(N-acetyl-glucosamine), ADI(adipate) 양성으로 다른 결과가 나왔다.

<Table 2>

Comparison of biochemical characteristics of the present isolates (MC9029SU, MC9029K) and the reference strains (ATCC 14126, ATCC 35084) using API 20NE strips (BioMérieux)

분리균의 API profile은 7676765로 표준균주인 ATCC 14126의 profile 7477745, ATCC 35084의 profile 7676645와 모두 다르게 나왔다(Buller, 2014). 또한 API web을 통한 분석 결과 모두 Aeromonas hydrophila/ A. caveiae와 Vibrio paraheamolyticus로 동정되고, V. harveyi와 상동성은 나오지 않았다.

3. 분자생물학적 동정

순수 분리된 분리균주 (MC9029SU, MC9029K)의 DNA를 Vibrio harveyi-specific primer toxRFL과 toxRR1를 사용하여 반응시킨 결과, 분리균주는 V. harveyi인 대조균주 ATCC 14126와 함께 382bp의 특이밴드가 형성되었다([Fig. 5]참조).

[Fig. 5]

Amplified fragments produced in PCR using V. harpeyi-specific primer sets, toxRFL and toxRR1 (382bp). Lane 1, 2 : Present isolates (MC9029SU, MC9029K). Lane 3: V. harveyi (ATCC 14126), V. alginolyticus (ATCC 17749), V. campbellii (ATCC 33863), V. ordalii (ATCC 33509), V. parahemolyticus (ATCC 17802), V. splendidus-I (ATCC 33125), Aeromonas hydrophila (ATCC700183).

16 rRNA gene squence 분석에서 분리균인 MC9029SU와 MC9029K의 gene을 NCBI의 Blast 분석한 결과, 분리균들은 모두 100%로서 각각 V. harveyi로 동정되었다. 16 rRNA sequence를 바탕으로 phylogenetic tree를 나타낸 결과 각각 분리균들은 V. harveyi와 가장 근접하였다([Fig. 6]참조).

[Fig. 6]

16SrRNA sequence-based phylogenetic tree of present isolate (MC9029SU) and related sequences from GenBank. The tree was generated using the neighbor-joining method.

4. 병원성

황복에 대한 병원성 실험에서 분리균 MC9029K를 4.8X10⁷ cfu/fish (0.1ml)를 복강 접종한 결과 Group 2(염분 농도 20‰)에서는 감염 증상 및 폐사가 나타나지 않았다. 그러나 Group 1(염분 농도 28‰)에서는 접종 2일 후부터 폐사하기 시작하였으며, 7일간의 폐사율은 80%로 높게 나타났다.

접종한 황복에서는 자연 감염어의 증상과 같이 턱과 복부의 피부에 출혈 증상이 보였으며, 생존 개체에서는 출혈 부위가 궤양으로 진행되었다([Fig. 7]참조). 내부 증상은 자연 발병어와 같이 간장의 퇴색과 미소한 갈색 반점이 형성되었다. 또한 폐사어 및 빈사어의 신장에서 접종균이 순수상태로 재분리되었다. 한편 대조군은 감염 증상과 폐사가 관찰되지 않았다.

[Fig. 7]

Symptoms of river puffer intraperitoneally injected with Vibrio harveyi (MC9029K). Hemorrhages (A) and shallow ulcer (B) on the skin of lower jar similar with those of naturally infected fish.

본 실험으로 보아 자연 발생어의 큰 궤양은 감염이 만성으로 진행되어 아가미 뚜껑과 두부의 궤양으로 생성된 것으로 보인다. 또한 Group 2의 실험에서는 증상 및 폐사가 일어나지 않은 것으로 보아 저염분 환경에서는 호염성 V. harveyi의 병원성이 저하된 것임을 알 수 있다. 본 실험의 해수 사육 친어에서 발병한 것도 이러한 경향이 반영된 것이라 생각된다.

Austin and Zhang(2006)은 해산어류의 V. harveyi의 감염 증상으로는 피부에 궤양 증상, 장염 증상 및 기타의 3종류로 구분하고 있다. 피부에 궤양이 형성되는 어종으로는 눈볼개 C. undecimalis (Kraxberger-Beatty et al., 1990), 귀족도미 C. plumbeus (Beatty et al., 1996), mangrove red snapper L. argentimaculatus (Krupesha et al., 2014), 세네갈서대 S. senegalensis (Rico et al., 2008), Arabian surgeon fish A. sohal (Hashem and El-barbary, 2013) 등에서 보고되었다. 한편 피부에 궤양은 형성됨이 없이 소화관 내에 노란색의 복수가 축적되는 심한 장염이 유발하는 어종으로는 summer flounder P. dentatus (Soffientino et al., 1999), red drum S. ocellatus (Liu et al., 2003), cobia fish R. canadum (Liu et al., 2004) 등이 있다.

본 연구에서의 황복도 피부에 특징적인 궤양이 형성되는 것을 특징으로 하는 질병으로 장염 증상은 발견되지 않았다. 이러한 증상은 수족관에서 30℃의 고수온에서 사육하였을 때의 황복에 발생한 V. harveyi감염증(Won et al., 2009)의 증상인 어체의 측면 또는 복부의 피부에 1개의 대형 궤양의 형성, 가슴지느러미, 배지느러미 및 뒷지느러미의 기부에 출혈과 내장기관인 간장의 퇴색이 주증상인 결과와 유사하였다. 황복의 V. harveyi의 감염 증상은 발병 온도에서 차이가 있지만, 외부 증상은 거의 유사한 것으로 추정된다. 한편 황복의 피부의 궤양 형성은 다른 어종인 잿방어의 V. harveyi의 감염 증상인 두부의 상피세포의 박리 증상과 유사하지만, 잿방어처럼 복수의 축적이나 안구염 및 꼬리지느러미의 결손이 일어나지 않는 차이점이 있다(Minami et al., 2016). 또한 양식 자주복의 V. harveyi감염도 수온이 25℃일 무렵에 체색이 검어지면서 새강에 결절이 형성되지만(Mohi et al., 2010), 황복에서는 자주복의 경우처럼 결절은 전혀 형성되지 않았다.

5. 병리조직학적인 관찰

감염된 황복의 아가미는 2차새변의 증생과 상피가 박리되고, 아가미 뚜껑의 근육과 상피가 괴사되었다.([Fig. 8]참조).

[Fig. 8]

A: Gill of river puffer naturally infected with Vibrio harveyi. Congestion of primary gill filament(C), desquamation (ED) and hyperplasia (H) of secondary gill filaments epithelia. B: Skin ulcer of infected fish. Necrosis (N) of epithelia and muscle layer, edema (E) of skeletal muscles.

간장은 정상 복어에 비하여 소형의 타원형 지방공포가 많이 보였다. 일반적인 성장이 좋은 자주복의 간세포는 대형 다각형의 지방공포가 세포질의 대부분을 차지하고 세포질은 거의 남아있지 않은 어류의 지방간과 같은 모양을 나타낸다. 반면, 성장이 불량한 개체는 세포질 내의 지방공포가 소형의 타원형으로 세포질은 상당수 남아 있다(Nakagawa et al., 1986). 이로 보아 V. harveyi 감염된 황복은 먹이 섭취 활동이 불량하여 성장에 악영향을 끼치는 것으로 추정된다.

신장과 비장은 출혈로 인한 hemosiderin의 침착되었지만, 염증과 괴사 등의 증상은 보이지 않았다([Fig. 9]참조). 감염어의 비장, 신장에는 멜라노마크로파지 센터와 hemosiderin 침전의 증가(Stephens et al., 2006)는 조직 손상에 대한 만성염증반응의 결과(Agius and Roberts, 2003)로 원인균인 V. harveyi의 만성적 감염에 의한 결과인 것으로 판단된다.

[Fig. 9]

A: Liver of healthy river puffer. Histological change in naturally diseased river puffer (B-D). B: Lipid vacuoles of hepatocytes in diseased fish was smaller than those of healthy fish. Increased number of MMCs and severe hemosiderin deposits in the kidney (C) and spleen (D) of diseased fish.

Acknowledgments

본 연구는 군산대학교 수산과학연구소의 지원에 의한 대어민 질병 상담업무의 일환으로 수행되었습니다.

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