해양유래미생물 항균 활성 Bacillus sp. 2-4 균주의 대량 배양방법

Ⅰ. 서 론

지난 20년간 양식 산업은 급격히 증가하였고 식량산업으로써 그 가치가 높아지고 있으나, 양식 도중 발생하는 어류질병이 양식 산업 발전에 심각한 악영향을 미치는 것으로 알려져 있다 (Kim et al., 2016). 일반적으로 육상수조 양식의 경우 단위 면적당 생산량을 극대화시키기 위해 고밀도 사육을 진행하고 있으며, 이러한 고밀도 사육은 각종 질병발생의 원인을 제공하고 어류의 폐사를 일으켜 경제적인 손실을 일으키고 있는 실정이다(Kim et al., 2014).

넙치의 양식과정에서 발생하는 주요 세균성 질병의 원인체로는 Edwardsiella sp., Streptococcus sp., Vibrio sp. 등이 보고되고 있다(Lee et al., 2007). 하지만 우리나라의 어류 양식산업은 어류질병의 예방보다는 치료위주의 대책으로 항생제를 사용하고 있으며, 이로 인해 어류의 잔류독성과 항생제에 대한 내성 세균이 출현하여 소비자들에게 불신을 안겨주고 있다(Kim et al., 2016).

지금까지 천연물질로부터 생리활성을 가진 천연물질의 연구는 주로 육상 자원을 대상으로 하여 왔지만 다년간의 연구를 통하여 새로운 원천이 고갈되는 양상을 보여 경제성이 떨어지고 있는 추세이다. 이에 선진국들은 해양 미생물 유래 천연물에 집중적인 연구를 하고 있으며 그 결과 현재까지 해양생물에서 약 5,500여종의 신물질이 개발되었다(Kim et al., 2006; Kim et al., 2011). 해양 유래 미생물의 천연물질 개발은 범세계적이며, 최근 세계적인 제약사들이 화학기반의 항생제 분야에서 생물유래 물질로의 전환 및 미생물을 이용하거나 그의 대사산물을 이용한 항균제 시장 진출 전략을 강화하는 움직임을 보이고 있다.

따라서, 본 실험에서는 항생제를 대처하여 어병세균을 억제할 수 있는 새로운 해양유래 미생물제제를 개발하기 위한 기초연구의 하나로서 어병세균에 항균능력이 우수한 Bacillus sp. 2-4 (KCCM1 1107P)의 대량배양을 위한 배양 조건과 항균활성을 증대시킬 수 있는 탄소원와 질소원을 선발하였다.

Ⅱ. 재료 및 방법

11. 파일럿 플랜트 생산 프로세스의 확립

확립된 산업배지 조성 및 최적배양조건을 바탕으로 Bacillus sp. 2-4균주의 파일럿 플랜트(2KL)의 생산 프로세스를 확립하였다. 먼저 스케일업 (scale-up) 단계는 Bacillus sp. 2-4 앰플 → 50 ml → 10 L → 2 KL의 단계로 진행되었고 각 단계별 접종량은 0.5%로 설정하였다. 단계별 배양 조건 및 배양 시간은 <Table 1>에 표기하였다.

<Table 1>

Culture conditions and culture time for each step

Ⅲ. 결 과

1. 용매 추출물의 항균활성 조사

어류질병을 일으키는 병원성 세균 3종에 대한 항균활성을 측정한 결과, E. tarda 32mm, V. anguillarum 15mm, S. parauberis 35mm의 클린존이 관찰되었다(<Table 2>).

<Table 2>

The result of antimicrobial sensitivity test by Bacillus sp. 2-4

2. 탄소원 및 질소원 선정

탄소원 실험결과, casein hydrolysate를 처리하였을 때, 생균수의 양이 가장 많은 것으로 나타났으며 glucose를 처리 시 항균능력이 가장 높은 것으로 관찰되었다([Fig. 1]). 또한, 질소원의 경우 yeast extract와 soybe an meal에서 균밀도와 항균력이 가장 높은 것으로 확인되었다([Fig. 2]). 본 결과를 통해 탄소원은 casein hydrolysate 및 glucose 질소원은 yeast extract 및 soybean meal로 선정하였다.

[Fig. 1]

Effects of various carbon sources on antifungal activity of Bacillus 2-4 (KCCM11107P).

[Fig. 2]

Effects of various nitrogen sources on antifungal activity of Bacillus 2-4 (KCCM11107P).

3. 탄소원 및 질소원 농도 선정

탄소원과 질소원의 농도에 따른 균밀도 및 항균능력을 조사하였다. 기본배지에 탄소원, 질소원, 무기염의 농도를 고정한 상태에서 상기 탄소원(casein hydrolysate 및 glucose)과 질소원(yeast extract 및 soybean meal)을 각각 0~4% 사이의 농도로 탄소원은 3:1, 질소원은 1:5로 혼합하여 처리한 결과, 총 탄소원은 2.0%, 질소원은 3.0%를 함유하였을 때 균밀도의 농도가 가장 높았으며, 가장 강력한 항균능력을 나타내었다 [Fig. 3 & 4]. 또한 상기 결과를 바탕으로 Bacillus sp. 2-4의 최적 산업배지 조성을 확립하였다(<Table 23>).

[Fig. 3]

Investigation on the bacterial density based on concentrations of carbon source and the antibacterial activity.

[Fig. 4]

Investigation on the bacterial density based on concentrations of nitrogen source and the antibacterial activity.

<Table 3>

Content of the growhth medium for incubation

4. 배양적정 온도 및 pH 조사

대량배양을 위한 온도 및 pH에 따른 배양 효율 분석 결과, 균밀도는 30℃, 35℃에서 배양 시 가장 높게 나타났으며, 항균능력은 30℃에서 높게 나타나 배양적온을 30℃로 선정하였다([Fig. 5]). pH 결과, pH 6~8사이에서 균주의 균밀도 및 항균능력이 뛰어난 것으로 확인되었으며, 특히 pH 7에서 가장 높은 항균능력이 관찰되어 적정 ph를 7로 선정하였다([Fig.6]).

[Fig. 5]

Investigation of proper temperature for culture.

[Fig. 6]

Investigation of proper pH for culture.

5. 공기 주입량에 따른 배양 효율 분석

배양 시 최적 공기 주입량을 확인한 결과, 공기 주입량 1.5 vvm까지 공기 주입량이 많을수록 증가하였지만, 0.5 vvm일 때, 항균능력이 가장 높았으나, 공기 주입량이 많을수록 항균 능력이 저하되는 것을 확인하였다([Fig. 7]).

[Fig. 7]

Investigation of proper air for culture.

6. 교반속도에 따른 배양 효율 비교

교반속도에 따른 균밀도 및 항균능력을 관찰한 결과, 교반속도가 증가할수록 균밀도가 높아지는 것으로 나타났으며, 100 rpm을 기점으로 교반속도가 증가할수록 항균능력이 저하되는 것으로 확인되었다.

[Fig. 8]

Investigation of proper churn speed for culture.

7. 파일럿 플랜트 생산 프로세스의 확립

파일럿 플랜트 (2 KL)의 생산 프로세스 확립 후 배양 및 생산을 진행한 결과, 배지 내 탄소원과 용존산소량의 변화는 배양 6시간 이후 급격하게 나타났고, 항균물질 중 8시간 때 조바실로 마이신(crude bacillomycin), 11시간 이후 조서펙틴 (crude surfactin)이 발생하기 시작하였으나, 배양 16시간 이후부터는 항균물질의 함량에 변화가 없는 것으로 나타났다([Fig. 9]).

[Fig. 9]

Checking production of substances due to culture production of 2 KL

8. 항균물질의 안정적인 대량배양 (20 KL) 기술 확립

해양 유래 미생물 Bacillus sp. 2-4 균주의 대량 배양 공정 체계 (20KL)의 배양적 특성 및 배양 후 공정은 <Table 4>에 나타내었으며, 20 KL의 대량배양 공정체계에 적용한 결과, 조바실로 마이신 및 조서펙틴이 생성되는 것을 확인하였으며, 이를 통해 균밀도 및 항균물질 생산량의 체계를 확립하였다([Fig. 10]).

<Table 4>

Cultural characteristics and processes after culture

[Fig. 10]

Checking production of substances due to culture production of 20 KL

Ⅳ. 고 찰

최근 산업화의 급속한 발달과 인구증가는 양식생물에 피해를 줄 뿐만 아니라 인간의 건강에까지 악영향을 미치고 있다(Heo et al., 2013). 양식생물에 대한 질병을 제어하기 위하여 각종 항생제를 남용하고 있으며, 그 결과 약제의 내성균까지 출현하였다(Aoki et al., 1973; Blackbum et al., 2010). 항생제가 어류나 최종 소비자인 사람의 체내에 장기간 축적될 경우, 약제 내성은 물론 균교대증이나 알레르기 유발 등의 안전성 문제가 발생할 수 있다. 이러한 문제점들을 해결하기 위해 천연물질을 사용하여 항생제물질을 대체하거나 병용 시에 그 효과를 상승시켜 항생제 사용을 감소 할 수 있는 항생제 대체물질의 개발 연구가 시급히 요구되고 있다(Heo et al., 2013)

미생물이 생산하는 대사산물은 화장품, 효소, 식품 및 의약품 산업 등 다양한 분야에서 상업적으로 이용되고 있으며(Choi et al, 2011), 현재도 여러 분야에서 미생물에서 생산하는 새로운 천연물질의 개발을 위한 잠재적인 소재로서 이들의 탐색과 응용을 위한 연구가 지속적으로 이루어지고 있다(Jung et al., 2009). 그 중, Bacillus sp. 세균들은 다양한 항균활성을 가지고 있어 광범위하게 많은 연구의 소재로 사용되고 있으며, 특히 Bacillus sp.가 생산하는 항진균 및 항균활성 물질에 관한 연구는 꾸준히 진행되고 있다(Choi et al., 2010). 본 연구에서 관찰된 Bacillus sp. 2-4균주가 생산하는 조바실로 마이신 및 조서펙틴 등의 항균활성물질에 의해 주요 어병세균에 대한 항균력이 관찰된 것으로 여겨진다.

일반적으로 Bacillus sp. 배양 시 glucose를 사용하고 있으며, glucose 양의 농도가 높을수록 인산가용화능력이 높게 나타나 병원균 억제에 효과가 있다고 보고되고 있다(Lee et al., 2013). 이러한 결과는 본 연구결과와 일치하였지만, cell density의 밀도가 상반적으로 수치가 낮아지는 이유는 일정한 세포밀도가 되면 증식이 중지되는 이유와 밀접한 관계가 있을 것으로 판단된다.

Joo and kim(2002)에 따르면 Bacillus ehimensis는 2 vvm까지 높은 길항력을 보이다가 3 vvm에서는 길항력이 증가하지 않았다고 보고하였다. 본 연구의 결과, 공기주입량이 1.5 vvm까지 항균능력이 높게 나타났지만, 그 이상에서는 항균능력이 떨어지는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 Bacillus sp.에 따라 필요한 공기주입량이 다른 것으로 여겨지며, 항균능력을 높이기 위해서는 Bacillus sp.에 맞는 적절한 공기주입량 조사가 필요할 것으로 여겨진다.

일반적으로 교반속도에 따라 산소전달계수값 (KLa)이 상승한다고 보고되고 있으며, 그 중, Bacillus thuringiesis는 교반속도가 낮을 때가 높을 때보다 KLa값이 더 높은 것을 확인할 수 있었다 (Kim et al., 2014). 본 연구진의 결과 100 rpm 이상에서 항균력이 떨어진 수치는 KLa와 연관성이 있는 것으로 추정되며, 추후 다른 종류의 Bacillus 배양 시 확인이 필요한 항목으로 여겨진다.

본 연구의 내용을 종합하여 볼 때, Bacillus sp. 2-4균주의 최적배양조건으로는 30℃, pH 7.0, 100 rpm, 0.5 vvm이었고, 탄소원, 질소원 실험을 통해 산출한 최적배지의 조성은 탄소원 2.0% (casein hydrolysate 및 glucose, 3:1), 질소원 3.0% (yeast extract 및 soybean meal, 1:5)로 조사되었다. 대량배양의 최적화를 위해 최적배지를 대상으로 20 KL를 이용하여 scale-up을 수행한 결과, 최종적으로 항균활성 물질인 조바실로 마이신, 조서펙틴이 안정적으로 생성되는 것을 확인하였다.

본 연구에서 사용한 Bacillus sp. 2-4는 국립수산과학원 및 제주대학교 해양연구소에서 어류의 증체율 향상 및 어병세균에 대한 저항성을 확인한 균주로서 항생제 대체용으로 그 효과가 입증되었고(Kim et al., 2017), 넙치의 세균성 질병 예방을 위한 친환경적인 사료첨가제 생산에 활용이 가능하다. 또한, 대량생산 산업화에 대한 기초데이터로써 유용하게 사용될 것으로 여겨지며, 앞으로 연속식 배양기법과의 비교연구가 수행되어야 할 것이다.

Acknowledgments

※ 이 논문은 해양수산과학기술진흥원 미래해양산업기술개발사업 (과제번호:20150040)으로 수행되었음.

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