먹장어 유래의 카텝신 B 유전자 클로닝, 발현 및 효소학적 활성 측정

Ⅰ. 서 론

먹장어(Eptatretus burgeri)는 한국과 일본 등 해안에 서식하며, 식용으로 많이 소비되고 있는 어종 중 하나이다. 주로 10 ~ 270m 깊이 바다에 서식한다. 먹장어는 척삭동물문(Chordata), 원구류강(Cyclostomata), 먹장어목(Myxiniformes), 꾀장어과(Myxinidae)에 속한다. 원구류강은 같은 어류에 속하는 경골어류와 연골어류와는 달리 턱뼈를 가지고 있지 않는 특징이 있다. 또한, 척삭동물문 중에 가장 하등한 종으로 알려져 있다. 이러한 이유 때문에 어류로 분류를 하지 않는 경우도 있지만 대부분은 어류로 분류를 하는 것이 일반적이다.

이렇듯 먹장어는 다른 어류와는 달리 눈이 퇴화되었고, 척삭(Notochord)을 가지며, 상대적으로 긴 장(Intestine)을 가지고 있다. 또, 피부(Skin)에는 점액을 분비하는 점액선(Mucous gland)이 있고, 비늘과 지느러미가 없는 특징을 가지고 있다(Do Yong-Hyun et al., 2014). 위와 같은 특징들 때문에 먹장어는 살아있는 화석이라 불리는 등 계통학적으로 중요한 위치를 차지하고 있다.

카텝신(Cathepsin) B는 시스테인(Cystein) 프로테아제(Protease)로 papain family에 속한다(Kirschke H. et al., 1995). 주로 세포에서는 외부에서 들어온 단백질을 리소좀 내에서 분해하는 과정에 관여한다(Bohley P. and Per Ottar Seglen, 1992). 카텝신 B의 기질(Substrate)이 결합하는 위치는 29번째의 시스테인(Cysteine)과 199번째의 히스티딘(Histidine) 부위이다(Musil Dj et al., 1991). 카텝신 B는 다른 시스테인 프로테아제와는 달리 아르기닌(Arginine)도 결합을 할 수 있는데, 245번째의 글루탐산(Glutamic acid)가 존재하기 때문이다(Hasnain S. A. D. I. Q. et al., 1993). 이 뿐만 아니라 펩티딜디펩티다아제(Peptidyldipeptidase)로서도 작용할 수 있다. 다른 papain family와는 달리 두 가지의 효소적 기능을 가지고 있기 때문에 상대적으로 엔도펩티다아제(Endopeptidase)로서의 기능이 떨어진다(Cygler Miroslaw et al., 1996).

차세대 염기서열 분석(Next Generation Sequencing, NGS)의 발달로 인하여 사람(Human), 쥐(Mouse) 등의 포유류와 어류에서는 모델생명체(Model organism)인 제브라피쉬(Zebrafish)처럼 게놈(Genome)의 정보와 유전자들의 정보가 알려져 있다. 하지만 먹장어 경우, 게놈 정보는 알려져 있지만, 유전자들의 대한 정보는 턱 없이 부족하다. 이러한 점에 착안하여 본 연구자들은 리소좀 내의 단백질 분해와 갑상선호르몬(Thyroid hormones)의 생성에 관여하는 카텝신 B를 연구대상 유전자로 선정하였다(Mort John S. and David J. Buttle, 1997).

본 연구에서는 먹장어 유래의 카텝신 B 유전자의 서열을 밝히고, 대장균(Escherichia coli)을 이용해 재조합 단백질(Recombinant protein)을 발현하였다. 재조합 단백질을 정제를 통해 순수하게 분리하여 활성 측정(Activity assay)을 하였다. 본 연구의 결과를 통해 식용과 가죽으로 쓰이는 먹장어와 카텝신 B에 대한 보다 나은 이해와 그로 인한 먹장어에 대한 관심의 증가로 인해 어가소득에 도움이 될 것으로 기대된다.

Ⅱ. 연구 방법

1. 먹장어(Eptatretus burgeri) Cathepsin B의 cDNA Cloning

E.burgeri cathetpsin B 유전자의 전체 길이를 식별하기 위해, 어류 cathpsin B에서 높게 보존된 부위에서 설계된 Oligonucleotides를 디자인하였다. 총 RNA는 하이브리드-R Kit (GeneAll)를 사용하여 먹장어로부터 분리하였다. cDNA는 Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche)와 SuperScript^TM RT (Invitrogen)를 사용하여 분리된 mRNA에서 합성되었다. 

SMART RACE cDNA amplification kit (Clontech)를 사용하여 cDNA 혼합물과 5‘-RACE 및 3’-RACE 프라이머인 먹장어 특이적인 프라이머와 Universal 프라이머를 이용하여 5‘-RACE와 3’-RACE cDNA를 제작하였다. 본 연구에 사용된 프라이머 서열은 <Table 1>에 수록하였다.

<Table 1>

Oligonucleotide primers used in PCR amplification of Cathepsin B gene of E. burgeri (F, Forward; R, Reverse)

증폭된 RACE 산물은 pGEM T-Easy 벡터(Promega)에 삽입하여 재조합체를 만들고, 이를 E.coli DH5α 수용 세포에 형질전환시켰다.

형질전환된 E.Coli는 100g/ml of ampicillin, 40g/ml 5-bromo-4-chloro-3-indoly—D-galactoranoside (X-Gal) 와 0.4 mM isopropyl-thiogalactopyranoside (IPTG)가 첨가된 Luria-Bertani 평판배지에서 배양하여, 무작위로 배양된 흰 군락을 골라 PureHelix Fast-n-Pure Plasmid Kit (NANOHELIX)를 사용하여 플라스미드 DNA를 추출하였다.

재조합된 염기서열은 M13(-20)F/M13(-20)R 프라이머를 이용하여 COSMO co, Ltd. (Seoul, Korea)에서 서열분석을 하였다. 밝혀진 염기서열은 GeneBankDatabase (http:www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)을 통하여 유사성을 조사하였다.

Ⅲ. 연구 결과

1. 먹장어(Eptatretus burgeri) Cathepsin B의 cDNA Cloning

먹장어 카텝신 B의 유전자 서열을 밝히기 위해, 먹장어 조직에서 추출한 total RNA로부터 합성한 cDNA를 사용하여 PCR을 진행하였다. 먼저, 일부 서열을 밝히기 위해 National Center for Biotechnology Information (NCBI)로부터 타종의 카텝신 B 유전자들을 이용해 degenerated primer를 제작하였다. 이를 통해 밝혀진 서열을 이용해 각각 5‘-RACE (Rapid Amplification of cDNA End) PCR (Polymerase Chain Reaction)와 3’-RACE PCR을 진행하였다.

클로닝 결과, 먹장어 카텝신 B의 염기서열 길이는 총 1694 bp 였으며, 5‘-UTR은 107 bp, 3’-UTR은 585 bp의 길이를 가지고 있었다. 또한, ORF는 1002 bp로 총 333개의 아미노산의 정보를 가지고 있었다([Fig. 1]). 이로부터 나오는 먹장어 카텝신 B의 분자량은 약 36.8 kDa으로 밝혀졌다.

[Fig 1]

Full nucleotide and amino acid sequences of EbCtsB

2. 먹장어(Eptatretus burgeri) Cathepsin B의 서열분석 및 계통학적 분석

먹장어 카텝신 B의 시그널 펩타이드(Signal peptide), 프로 펩타이드(Pro peptide), mature peptide를 알기 위해 분석을 실시하였다. 분석 결과, 1번째 메티오닌(Methionine)부터 20번째 프롤린(Proline)까지가 시그널 펩타이드, 21번째 프롤린(Proline)부터 80번째 글루탐산(Glutamic acid)까지 프로 펩타이드, 81번째 류신(Leucine)부터 333번째 아르기닌(Arginine)까지가 mature peptide로 밝혀졌다([Fig 2]).

[Fig 2]

Comparison of amino acid sequences between EbCtsB and other species CtsB. Red lines indicate cleavage site. Black arrows indicate end site of signal peptide and start site of pro peptide and mature peptide, respectively. Red boxes indicate active site.

아미노산의 서열 유사성 분석을 위해 NCBI genebank로부터 연어(Salmo salar), 넙치(Paralichthys olivaceus), 부세(Larimichthys crocea), 닭(Gallus gallus), 제브라피쉬(Danio rerio), 잉어(Cyprinus carpio), 캐롤리나 애놀(Anolis carolinensis)의 카텝신 B 아미노산 서열을 얻었다. 이를 이용해 타종의 카텝신 B와 먹장어 카텝신 B의 아미노산 서열의 유사성을 비교하였다. 비교 결과, GNFD motif 중 글리신(Glycine), 아스파라긴(Asparagine), 페닐알라닌(Phenylalanine)은 동일한 아미노산을 가지고 있었지만, 아스파르트산(Aspartic acid) 자리에는 프롤린(Proline)이 존재하였다. 또한, 활성부위(Active site)인 시스테인(Cystein), 글루탐산(Glutamic acid), 아스파라긴(Asparagine)은 다른 종과 일치하는 아미노산을 가지고 있었다.

계통학적 분석을 위해 다른 종의 프로테아제(Protease) 아미노산 서열을 NCBI로부터 얻었다. 프로테아제의 아웃그룹(Out group)으로는 아스파르트산 프로테아제(Aspartic protease)와 세린 프로테아제(Serine protease)를 사용하였다. 또, 카텝신 B-like의 아웃그룹으로는 카텝신 L-like를 사용하였다.

계통학적 분석 결과, 먹장어의 카텝신 B는 다른 종의 시스테인 프로테아제(Cysteine protease)와 같은 계통이며, 그 중, 카텝신 B와 한 그룹으로 묶이는 것을 확인하였다([Fig 3]).

[Fig 3]

Result of phylogentic tree analysis.

3. 재조합 proEbCtB의 E.Coli 발현 및 정제

먹장어 카텝신 B의 재조합 단백질(Recombinant protein)을 발현 후 정제를 하였다. 균주는 대장균(Escherichia coli) BL21(DE3)를 사용하였고, 재조합 단백질 정제를 위해서는 glutathione S-transferase (GST)를 이용한 친화성 크로마토그래피(Affinity chromatography) 방법을 사용하였다. 정제된 단백질 확인은 SDS-PAGE와 western blotting하여 60 Kda의 재조합 단백질을 확인하였다([Fig 4]).

[Fig. 4]

Expression and purification of recombinant proEbCtB. (A) Protein samples were separated by 12% SDS–PAGE and were visualized Coomassie R-250 blue staining. (B) Western blotting analysis of the SDS–PAGE separated proteins using monoclonal anti-GST antibody. Lane M, standard size marker; lane 1, whole cell lysate of E. coli BL21(DE3) with expression vector (pGEX 4T-1-Self); lane 2, whole cell lysate from 0.4mM IPTG-induced GST expressing E. coli BL21(DE3) with expression vector (pGEX 4T-1-Self); lane 3, whole cell lysate from IPTG-not induced EbCtB-expressing E. coli cells; lane 4, whole cell lysate from 0.4mM IPTG-induced proEbCtB-expressing E. coli cells; lane 5, purified proEbCtB protein. The asterisk (*) indicates the purified proEbCtB protein (60 kDa).

4. 효소학적 분석

정제된 재조합 단백질을 사용하여 다양한 pH, 기질(Substrate), 저해제(Inhibitor), 금속이온(Metal ion) 및 계면활성제(Detergent) 조건에 따라 먹장어 카텐신 B의 활성을 측정하였다.

우선, pH의 조건은 pH 3부터 pH 11까지 0.5 간격으로 측정하였으며, 기질은 Z-RR-AMC와 Z-FR-AMC를 사용하였다. Z-RR-AMC의 경우, pH 3부터 pH 5까지는 큰 변화가 없다가, pH 5.5부터 활성이 증가하여 pH 7.5에서 가장 좋은 활성을 보였다([Fig 5a]). Z-FR-AMC는 pH 4부터 활성이 증가하여 pH 8에서 가장 좋은 활성을 보였다([Fig 5b]).

[Fig 5]

Activity of EbCtsB in diverse pH conditions. (a) Result of using Z-RR-AMC as substrate. (b) Result of using Z-FR-AMC as substrate

다양한 기질 조건에는 기질로 Z-FR-AMC, Z-RR-AMC, Z-GPR-AMC, Z-LLE-AMC, Z-AAF-AMC, Z-GGR-AMC, MeOSuC-AAPV-AMC, SVC-LLVY-AMC, Bz-RGFFP-4MeOβNA를 사용하였다. Z-RR-AMC를 사용했을 때, 먹장어 카텝신 B의 활성이 가장 좋았고, Bz-RGFFP-4MeOβNA를 기질로 사용하였을 때가 가장 나쁜 활성을 나타내었다([Fig 6]).

[Fig 6]

Activity of EbCtsB in diverse substrates.

저해제로는 E-64, Antipain, Chymostain, NEM, PMSF, Aprotinin, EDTA, EGTA, Pepstatin A를 사용하여 실험하였다. 가장 강력한 저해제로 antipain이 작용하였고, E-64와 EGTA가 가장 약한 저해제로 작용하였다([Fig 7]).

[Fig 7]

Activity of EbCtsB in diverse inhibitors

마지막으로 금속이온으로 ZnSO₄, CuSO₄, MgSO₄, HgCl₂, CaCl₂, KCl을 사용하였다. 또, 계면활성제는 Triton X-100, Tween 20, SDS, Brij35를 사용하였다. 각각의 금속이온과 계면활성제는 10mM과 50mM의 두 가지의 농도로 처리하여 실험을 진행하였다. 먼저, 10mM의 농도에서 MgSO₄와 Tween 20 처리조건에서 먹장어 카텝신 B의 활성이 크게 바뀌지 않았고, ZnSO₄와 SDS 처리 조건에서 활성이 크게 감소하였다([Fig 8a]). 50mM의 농도에서는 10mM의 농도와 비교하였을 때 전체적인 경향은 비슷하게 보이지만 활성과 억제의 효과가 더욱 강하게 나타났다([Fig 8b]).

[Fig 8]

Activity of EbCtsB in diverse metal ions and detergents. (a) Result of using 10mM concentration. (b) Result of using 50mM concentration.

Ⅳ. 고찰 및 결론

본 연구에서는 먹장어 유래의 카텝신 B의 유전자 서열 전체를 동정하고, 이에 따른 단백질 서열을 밝혔다. 먹장어 카텝신 B의 염기서열은 총 1694 bp였으며, 이 중 ORF의 길이는 1002 bp였다. 이로부터 번역(Translation)되는 단백질은 총 333개의 아미노산으로 이루어져 있으며, 분자량은 약 36.8 kDa이었다. 시그널 펩타이드는 20개의 아미노산으로 이루어져 있고, 프로 펩타이드는 60개의 아미노산으로 이루어져 있었다. 이를 제외한 mature protein은 253개의 아미노산으로 구성되어 있었다.

타종의 카텝신 B와 아미노산 서열의 유사성도 비교하였다. 비교 결과, 대부분 60% 이상의 유사도를 보였다. 그 중, papain family에 속하는 시스테인 프로테아제의 접힘(folding)과 안정성(stability)에 영향을 주는 GNFD 모티프를 분석하였다(Karrer, Kathleen M., Stacia L. Peiffer, and Michele E. DiTomas., 1993). 분석 결과 글라이신(Glycine), 아스파라긴(Asparagine), 페닐알라닌(Phenylalanine)은 동일하게 존재하였지만, 아스파르트산(Aspartic acid)을 대신하여 프롤린(Proline)이 존재하였다. 이러한 차이 때문에 먹장어의 카텝신 B의 접힘이 달라지게 되어 활성 및 안정성에 영향을 줄 수 있을 것으로 예상이 된다. 또한, 활성 부위(Active site)인 시스테인(Cysteine), 글루탐산(Glutamic acid), 아스파라긴(Asparagine)은 서열의 변화가 없었다. 따라서 기질(Substrate)이 활성 부위에 접합(Binding)하는 것에는 영향을 미치지 않을 것으로 예상이 된다.

계통학적 분석 결과에서도 먹장어의 카텝신 B는 시스테인 프로테아제와 카텝신 B-like들과 한 그룹으로 묶이는 결과를 보였다.

먹장어 유래 카텝신 B의 유전자 서열 분석, 단백질 서열 분석, 계통학적 분석 결과를 종합하면 본 연구진이 밝힌 서열은 카텝신 B라고 예측을 할 수 있다.

더 정확하게 카텝신 B라는 것을 확인하기 위하여 재조합 단백질(Recombinant protein)을 만들어 효소학적 활성을 측정하였다. 조건은 pH, 기질(Substrate), 저해제(Inhibitor), 금속이온(Metal ion), 계면활성제(Detergent)를 달리하여 진행하였다.

pH의 경우에는 Z-RR-AMC와 Z-FR-AMC에서 각각 pH 7.5와 pH 8에서 가장 좋은 활성을 보였다. 일반적으로 알려진 카텝신 B의 최적 활성 조건은 pH 6으로 알려져 있는데(Barrett, Alan J., and Heidrun Kirschke., 1981)), 먹장어의 활성 조건은 이것과 차이가 난다. 이러한 결과의 이유는 카텝신 B의 접힘에 관련된 GNFD 모티프의 아미노산 서열의 차이가 생겨 구조가 달라졌을 가능성이 있다.

기질은 총 9가지를 사용하여 실험을 하였다. 가장 활성이 좋았던 기질은 Z-RR-AMC로 대표적인 카텝신 B의 기질이다. 다음으로는 세린(Serine) 프로테아제의 기질인 Z-FR-AMC, 프로테아제의 한 종류인 우로키나아제(Urokinase)의 기질인 Z-GGR-AMC, 프로테아좀(Proteosom)의 기질인 Z-LLE-AMC 순으로 활성이 좋았다. 카텝신 K의 기질인 Z-GPR-AMC, 트라이펩티딜 펩티다아제(Tripeptidyl peptidase)의 기질인 Z-AAF-AMC, 프로테아좀(Proteosom)의 기질인 SVC-LLVY-AMC가 비슷한 활성을 보여주었다. 마지막으로 엘라스테아제(Elastase)의 기질인 MeOSuC-AAPV-AMC와 카텝신 D의 기질인 Bz-RGFFP-4MeOβNA의 활성이 가장 좋지 않았다. 카텝신 B의 기질인 Z-RR-AMC에서 가장 활성이 좋았다는 점을 고려하면 본 연구자들이 정제한 단백질이 카텝신 B의 기능을 할 수 있다는 것을 알 수 있다.

저해제를 사용한 실험에서는 antipain 조건에서 먹장어 카텝신 B의 활성이 가장 억제되었다. 이것은 기존에 알려진 antipain이 카텝신 B의 활성을 억제한다는 것과 동일한 결과이다(Suda, Hiroyuki et al., 1972). 추가적으로 주목할 점은 기존의 연구 결과에 의하면 카텝신 B는 E-64에 의해 활성이 억제되지만(Hanada Kazunori et al, 1978), 먹장어 카텝신 B의 경우에는 강하게 억제가 되지 않았다는 점이다.

금속이온을 사용한 실험에서는 먹장어 카텝신 B의 활성을 억제하는 경우와 증가시키는 경우 두 가지로 나누어졌다. 먼저, 먹장어 카텝신 B는 ZnSO₄, CuSO₄, HgCl₂에 의해서 활성이 억제되었는데, 이것은 기존의 연구 결과에서 보고된 것과 일치하는 내용이다(Kamboj Ramesh C., Suresh Pal, and Hari Singh., 1990). 먹장어 카텝신 B는 MgSO₄와 CaCl₂ 조건에서 활성이 증가하는 결과를 보였다. 10mM의 조건에서는 활성의 증가 효과를 보이지 않지만 50mM의 조건에서 활성 증가의 효과를 보인다. 이것은 10mM의 농도가 두 금속이온이 충분한 효과를 보이기에는 부족한 양이라서 그런 것으로 생각된다.

다양한 계면활성제의 효과를 보기 위한 실험에서는 SDS가 가장 강력한 억제효과를 보였다. 10mM의 농도에서는 SDS를 제외하고는 큰 억제 효과를 보이지 못하였으나, 50mM에서는 SDS를 비롯한 다른 계면활성제들도 억제 효과가 나타났다. 이 효과는 계면활성제에 의한 먹장어 카텝신 B의 구조 변화로 해석할 수 있다.

먹장어는 식용뿐만 아니라 가죽제품으로 쓰이는 등 활용되는 분야가 다양하다. 하지만 아직까지 먹장어에 대한 연구는 턱없이 부족하다. 따라서 본 연구를 통해 밝혀진 먹장어의 카텝신 B 유전자에 대한 정보가 앞으로 진행될 먹장어 관련 연구에 기초자료로써 사용될 수 있기를 기대한다.

Acknowledgments

이 논문은 부경대학교 자율창의학술연구비(2017년)에 의해 연구되었음

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