The Korean Society Fishries And Sciences Education

[ Article ]

The Journal of the Korean Society for Fisheries and Marine Sciences Education - Vol. 31, No. 6, pp.1592-1606

ISSN: 1229-8999 (Print) 2288-2049 (Online)

Print publication date 31 Dec 2019

Received 14 Oct 2019 Revised 31 Oct 2019 Accepted 07 Nov 2019

DOI: https://doi.org/10.13000/JFMSE.2019.12.31.6.1592

Tiamulin 항생제가 Streptococcus parauberis KSP28에 감염된 넙치(Paralichthys olivaceus)에 나타내는 치료효과와 부작용

주민수 ; 김보성^* ; 김도형^** ; 이지훈^*** ; 서정수^*** ; 권문경^**** ; 박찬일^†

경상대학교(학생)
*국립수산과학원(연구사)
**부경대학교(교수)
***국립수산과학원(연구사)
****국립수산과학원(연구관)
†경상대학교(교수)

Therapeutic Effects and Side Effects of Tiamulin Antibiotics on Streptococcus parauberis KSP28 infected Olive Flounder (Paralichthys olivaceus)

Min-Soo JOO ; Boseong KIM^* ; Do-Hyung KIM^** ; Ji-Hoon LEE^*** ; Jung-Soo SEO^*** ; Mun-Gyeong KWON^**** ; Chan-Il PARK^†

Gyeongsang National University(student)
*National Institute of Fisheries Science(researcher)
**Pukyong National University(professor)
***National Institute of Fisheries Science (researcher)
****National Institute of Fisheries Science(senior researcher)
†Gyeongsang National University(professor)

Correspondence to: ^†055-772-9153, Vinus96@hanmail.net

Abstract

The diseases caused by Streptococcus sp. are frequently outbreak in olive flounder aquaculture farms in South Korea, and antibiotics are often abused to control the disease. This results in resistant strains that cannot be treated with existing fisheries antibiotics. In order to apply to other antibiotics, research on use, dosage and safety are essential. Tiamulin is an antibiotic that has good activity against mycoplasma and Gram-positive bacteria. It is mainly used in swine, cattle and poultry. Streptococcus parauberis KSP28 infected flounder had the best therapeutic effect at 15 mg/kg when injected intramuscularly, and 15 mg/kg and 30 mg/kg had the same effect when administered orally. However, intramuscular injection showed inflammation and necrosis of the muscles, and glomerulonephritis, renal tubular atrophy, Bowman’s capsule expansion, and reticuloendothelial system activity at the high dose group. Therefore, it is not appropriate to apply tiamulin injection to olive flounder because of the serious side effects. In addition, further studies should identify side effects of oral tiamulin administration.

Keywords:

Tiamulin, Olive flounder, Streptococcus parauberis, Therapeutic effects, Side effects

Ⅰ. 서 론

넙치, Paralichthys olivaceus는 2018년 기준 우리나라 전체 해산어 양식 생산량 80,127톤 중 37,238톤으로 46.2%의 생산 비율을 차지하고 있는 대표적인 양식 어종이다(Korean statistical information service, KOSIS). 하지만 수산생물질병으로 인해 매년 폐사가 발생하여 경제적 피해를 입고 있는 실정이다.

2011년, 전국 총 70개소의 넙치 양식장에서 폐사 원인을 조사한 결과 병원체 감염에 의한 넙치 폐사량의 13.57%가 연쇄구균에 의한 것으로 밝혀졌다(Kim et al., 2012). 또한 2015년부터 2017년 까지 전남과 제주의 넙치 양식장을 대상으로 폐사 원인을 분석한 결과, 연쇄구균에 의한 폐사 발생 비율이 2015년 9.76%, 2016년 7%, 2017년 2%로 확인되었으며(Shim et al., 2019) 이전 연구에 의하면 2016년 3월부터 2017년 10월까지 제주지역 넙치 양식장으로부터 연쇄구균병이 발생한 넙치 161마리 중 S. parauberis에 감염된 넙치가 160마리로 나타나 S. parauberis 균주에 의한 연쇄구균병이 많이 발생하고 있는 것으로 확인되었다(Lee et al., 2018). 이러한 질병들을 치료하기 위해 수산 양식 현장에서는 다양한 항생제들을 사용하고 있다(Kim et al., 2014).

그러나 수산용 의약품의 오·남용으로 인하여 양식 생물의 안전성과 수산식품의 공중위생학적 안전성에 부정적인 영향을 미치며(Katz and Brady, 2000), 내성균이 출현하게 되는 문제가 발생하고 있다(Smith et al., 1994). 내성균주의 출현으로 인해 발생하는 문제들을 해결하기 위해서는 기존의 수산용 의약품을 대체할 수 있는 새로운 의약품의 적용이 필요하며 어병 세균에도 좋은 효과를 나타낼 가능성이 있는 동물용 의약품에 대한 연구가 필요하다.

Tiamulin은 pleuromutilin 계열에 속하는 반합성 항생제이다. Tiamulin은 세균 50S ribosomal subunit의 23rRNA에 강한 친화성을 나타내며 번역이 시작될 때 peptidyl transferase center에 관여하여 펩타이드 결합을 방해하고 세포벽 합성을 억제함으로써 정균활성을 나타낸다(Poulsen et al., 2001). Tiamulin은 mycoplasma나 연쇄구균, 포도상구균과 같은 그람양성균에 대한 항균력이 좋으며 그람음성균에는 비교적 약한 활성을 나타낸다(Werner et al., 1978, Messier et al., 1990). 따라서 우리나라의 축산 농가에서 주로 돼지의 돈적리, 돼지와 가금류의 이질, 폐렴, mycoplasma 감염에 대한 치료제로써 사용되고 있다.

연쇄구균으로 인해 경제적 피해를 받고 있는 넙치 양식 산업에 tiamulin의 적용 가능성을 확인하기 위해서는 연구를 통해 적절한 투여 농도와 방법, 그리고 넙치에 대한 안전성 등을 확인하고 수산용의약품으로의 안전사용기준을 마련하여야 한다. 따라서 이번 연구에서는 연쇄구균에 감염된 넙치에 대한 tiamulin의 치료 효과와 부작용을 조사하였다.

Ⅱ. 연구 방법

1. 연쇄구균

2005년, 전라남도 완도 소재의 연쇄구균에 의한 질병이 발생한 양식장의 감염된 넙치에서 분리된 S. parauberis KSP28 균주를 부경대학교로부터 분양받아 사용하였다. 균주는 1% NaCl이 첨가된 Brain Heart Infusion Agar (BHIA; Difco., USA)를 사용하여 27℃에서 24시간 배양하였고, 실험에 사용될 때까지 –80℃에 보존하였다. 실험에 사용할 때에는 –80℃에 보관되어 있던 균주를 27℃에서 BHIA에 24시간 배양하고 순수한 colony를 BHI broth에 계대하여 24시간 배양한 후 사용하였다. 또한, 균주를 동정하기 위하여 연쇄구균의 23S rRNA 염기서열에 특이적인 primer를 이용한 polymerase chain reaction (PCR)을 통해 해당 균종을 확인하였다(<Table 1>). PCR 조건은 94℃에서 2분간 initial denaturation 하고, 후에 92℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 90초를 1회로 하여 총 25회 반응시켰으며, 마지막으로 72℃에서 5분간 final extension 하였다. 동정된 연쇄구균은 인위감염에 사용되었으며, 실험 중에 분리되는 균주들 또한 동정하여 연쇄구균임을 확인하였다.

Specific primer for S. parauberis detection

2. Tiamulin 항생제

㈜성원에서 제조한 성원 티아물린 10% 주사액(본제 1 mL 중 티아물린 100 mg, 프로필렌글리콜 0.2 mL, 벤질알콜 0.01 mL 함유)을 근육주사용으로 사용하였으며 ㈜우진B&G에서 제조한 데나가드 39 (본제 1 kg 중 티아물린 39 g 함유)를 경구 투여용으로 사용하였다.

3. Tiamulin의 치료효과와 부작용 확인

가. 실험어

실험어는 경상남도 거제 소재의 한 양식장으로부터 구입한 넙치로 S. parauberis에 감염된 이력이 없는 것을 사용하였다. Tiamulin 근육주사 치료효과 실험에 사용된 넙치는 평균 체장 16.3 ± 1.6 cm, 평균 체중 60.2 g ± 9.6 g이었으며 tiamulin 경구 투여 치료효과 실험과 부작용 확인에 사용된 강도다리는 평균 체장 19.6 ± 1.9 cm, 평균 체중 97.3 ± 10.8 g 이었다. 실험에 사용하기 전 일주일간 250 L의 유수식 수조에 순치하였다. 실험에 사용된 해수는 여과조를 거쳐 이물질을 제거하여 사용하였고 유수량은 약 2 L/min이었으며 지속적인 유수를 통하여 수질을 유지하였다.

나. Tiamulin 근육주사의 치료효과 조사

연쇄구균에 감염된 넙치에 대하여 tiamulin을 농도별로 근육주사 하였을 때 나타나는 치료효과를 확인하기 위해 먼저 S. parauberis KSP28 균주를 3×10⁶ CFU/fish의 농도가 되도록 phosphate buffered saline (PBS)에 현탁시키고 넙치의 등지느러미 기부에 100 µL씩 피하주사 하여 인위감염 시켰다. 인위감염을 실시하고 24시간 후에 tiamulin을 5, 10, 15 mg/kg의 농도가 되도록 PBS에 현탁하여 넙치의 등근육에 100 µL씩 근육주사 하였다. 실험 수온은 가온기를 통해 26℃를 유지하였다. 음성대조구는 연쇄구균과 tiamulin 대신 PBS 만을 주사하였고 양성대조구는 연쇄구균을 인위감염시킨 후에 tiamulin 대신 PBS만을 근육주사 하였다. 대조구에 사용된 넙치는 각 10미 였으며 실험구에는 각 20미의 넙치를 사용하였다. 총 14일 간 나타나는 폐사율을 관찰하였고 15일 째에는 생존한 개체를 전량 benzocaine으로 용법과 용량에 맞게 마취시키고 해부하여 신장과 비장을 통해 감염 여부를 확인하고 감염률을 조사하였다.

다. Tiamulin 경구 투여의 치료효과 조사

연쇄구균에 감염된 넙치에 대하여 tiamulin을 농도별로 경구 투여 하였을 때 나타나는 치료효과를 확인하기 위해 먼저 S. parauberis KSP28 균주를 3×10⁶ CFU/fish의 농도로 피하주사하여 인위감염시켰다. 인위감염 실시한지 24시간 후 부터 1일 1회씩 5일간 tiamulin을 15, 30 mg/kg의 농도로 100 µL씩 zonde를 사용하여 넙치의 위장에 직접 경구 투여 하였다. 실험 수온은 가온기를 통해 26℃를 유지하였다. 대조구는 연쇄구균을 인위감염시킨 후에 tiamulin 대신 PBS만을 경구 투여하였다. 실험에 사용된 넙치는 각 12미였다. 총 14일 간 나타나는 폐사율을 관찰하였고 15일 째에는 생존한 개체의 감염률을 조사하였다.

라. Tiamulin의 부작용 조사

Tiamulin을 근육주사 하였을 경우 넙치의 근육과 신장, 간에 미치는 부작용을 확인하기 위해 병리조직학적 분석과 혈액학적 검사를 실시하였다. 대조구와 15 mg/kg, 30 mg/kg, 60 mg/kg의 농도로 근육주사한 실험구를 포함한 총 세 가지 구간으로 나누어 실험을 진행하였다. 주사한 후 1, 2, 4, 7, 14, 21일째에 각각의 수조에서 3마리씩 무작위로 선택하여 마취시킨 후 미부정맥으로부터 혈액을 채취하고 해부를 통해 간, 신장, 근육(항생제 주사부위)을 적출하였다. 채취한 혈액으로부터 7000 rpm에서 10분간 원심분리를 통해 혈청을 분리하였고 혈청 분석기(FUJI DRI-CHEm 4000i, Japan)로 alanine aminotransferase (ALT)와 aspartate aminotransferase (AST) 수치를 분석하였다. 도출된 결과들 사이의 유의차는 one-way analysis of variance (ANOVA) test로 확인하였고 사후검정은 Tukey test를 통해 실시하였다(p<0.05). 적출한 조직은 10% 중성 포르말린으로 전 고정하고 해당 시료를 세절하여 동일한 고정액에 후 고정하였다. 이후 70%에서 100% 에탄올로 순차적인 탈수, xylene으로 투명화, paraplast로 치환 과정을 통하여 각 장기를 4 µm 두께로 절편 제작하여 H&E 염색을 실시하였다. 그 후에 염색된 장기 절편들을 광학현미경상에서 400배율로 관찰하였다. 관찰하여 나타나는 병적 증상은 정도에 따라 정상, 경도, 중등도, 심도로 구분하였다.

Ⅲ. 연구 결과

1. Tiamulin의 치료효과

가. 근육주사 농도별 치료효과

(1) 누적 폐사율

음성대조구에서는 14일간 폐사가 발생하지 않았고 양성대조구의 최종 누적 폐사율은 80%로 확인되었다. 5 mg/kg 실험구는 55%, 10 mg/kg 실험구는 50%의 최종 누적 폐사율을 나타내었으며 15 mg/kg 실험구의 최종 누적 폐사율은 15%로 가장 낮게 나타났다([Fig. 1]).

[Fig. 1]

Determination of cumulative mortality from each concentration of tiamulin I.M. injection against olive flounder infected with S. parauberis KSP28.

(2) 생존 개체의 감염률

실험 종료 후 생존한 개체들의 감염률을 측정한 결과, 음성대조구 0%, 양성대조구 50%, 5 mg/kg 실험구 44%, 10 mg/kg 실험구 10%, 15 mg/kg 실험구 11.7%로 확인되었다(<Table 2>).

The cumulative mortality, infection rate and relative survival rate of therapeutic studies in S. parauberis KSP28 infected olive flounder by tiamulin I.M. injection.

나. 경구 투여 농도별 치료효과

(1) 누적 폐사율

양성대조구의 최종 누적 폐사율은 100%로 확인되었다. 15 mg/kg 실험구와 30 mg/kg 실험구 모두 33%의 최종 누적 폐사율을 나타내었다([Fig. 2]).

[Fig. 2]

Determination of cumulative mortality from each concentration of tiamulin oral administration against olive flounder infected with S. parauberis KSP28.

(2) 생존 개체의 감염률

실험 종료 후 생존한 개체들의 감염률을 측정한 결과, 15 mg/kg 실험구 50%, 30 mg/kg 실험구 50%로 확인되었다(<Table 3>).

The cumulative mortality, infection rate and relative survival rate of therapeutic studies in S. parauberis KSP28 infected olive flounder by tiamulin oral administration.

3. Tiamulin의 부작용

가. Tiamulin 근육주사로 인한 폐사

항생제를 등 근육에 농도별로 주사한 직후 주사 부위 피부가 검게 변색되는 것을 확인할 수 있었으며, 근육 조직 내에 출혈이 발생하였다([Fig. 3]). 또한 주사 후 2시간 내에 30 mg/kg 실험구에서 32%, 60 mg/kg 실험구에서 68%의 폐사가 발생하였다. 대조구와 15 mg/kg 실험구에서는 폐사가 나타나지 않았다(<Table 4>).

The cumulative mortality rate of side effect studies in S. parauberis KSP28 infected olive flounder by tiamulin I.M. injection

[Fig 3]

Skin appearance and muscle hemorrhage of olive flounder immediately after intramuscular injection of tiamulin.

나. 혈청 내 AST/ALT 수치 측정

(1) AST 수치

항생제를 등 근육에 농도별로 주사한 지 1일째에 대조구는 평균 17 U/L로 나타났고 15 mg/kg 실험구는 평균 72.3 U/L, 30 mg/kg 실험구는 평균 351 U/L로 확인되었다. 이는 대조구에 비해 모두 유의적으로 높은 값으로 확인되었다. 주사한 지 2일째에 대조구는 평균 30 U/L, 15 mg/kg 실험구는 평균 28.3 U/L로 유의적인 차이가 나타나지 않았지만 30 mg/kg 실험구는 평균 597.6 U/L로 상당히 높은 수치를 나타내었다. 주사한 지 4일째부터 21일째 까지는 대조구와 실험구에서 유의적인 차이를 확인할 수 없었다([Fig. 4]).

[Fig. 4]

AST values in the plasma of the olive flounders that were injected I.M. with tiamulin at each concentration.

(2) ALT 수치

항생제를 등 근육에 농도별로 주사한 지 1일째에 대조구는 평균 6.6 U/L로 나타났고 15 mg/kg 실험구는 평균 13.6 U/L, 30 mg/kg 실험구는 평균 87.6 U/L로 나타났으며 대조구와 15 mg/kg 실험구 사이에는 유의적인 차이가 나타나지 않았으나 대조구와 30 mg/kg 실험구 사이에는 유의적인 차이가 확인되었다. 주사한 지 2일째부터 21일째까지 대조구와 실험구 간에 유의적인 차이는 확인할 수 없었다([Fig. 5]).

[Fig. 5]

ALT values in the plasma of the olive flounders that were injected I.M. with tiamulin at each concentration.

(2) 근육주사 후 조직 안전성 검사

간조직을 관찰한 결과, 대조군을 포함한 모든 개체에서 지방간과 간위축이 관찰되었으며 4일차의 30 mg/kg 실험구에서는 심도의 간염과 간괴사가 발생한 것을 관찰할 수 있었다([Fig. 8-y]). 또한 7일차에 심도의 간염과 중등도의 간괴사가 발생한 것을 확인할 수 있었다([Fig. 9-v]). 근육조직을 관찰한 결과 대조구에서는 전체 샘플에서 괴사나 염증이 관찰되지 않았고 15 mg/kg 실험구의 경우 2일차에 경도의 염증이 확인되었고([Fig. 7-n]) 4일차에는 중등도의 염증과 괴사가 확인되었다([Fig. 8-k, n, q]). 하지만 이후 괴사나 염증이 관찰되지 않았다. 30 mg/kg 실험구의 경우 2일차([Fig. 7-t, w]), 4일차([Fig. 8-t, w, z]), 7일차([Fig. 9-t, w, z]) 까지 중등도의 염증과 괴사가 발생한 것을 확인할 수 있었고, 14일차부터는 경도의 염증만이 관찰되었다([Fig. 10-w]). 신장조직을 관찰한 결과 대조구를 포함한 대부분의 개체들에서 경도의 조혈활성과 사구체신염이 확인되었다. 1일차의 30 mg/kg 실험구의 경우 중등도의 세뇨관 위축과 경도의 보먼주머니 확장이 관찰되었고([Fig. 6-u, A]), 2일차에 경도 및 중등도의 보먼주머니 확장이 확인되었다([Fig. 7-l, r, u, A]). 4일차에는 30 mg/kg 실험구에서 중등도의 세뇨관 위축과 세망내피계 활성이 관찰되었다([Fig. 8-u, A]). 7일차에는 15 mg/kg 실험구와 30 mg/kg 실험구에서 중등도의 사구체신염과 세뇨관위축, 경도의 보먼주머니 확장이 확인되었다([Fig. 9-l, o, r, u, x, A]). 이후 21일차 까지 실험구에서 경도의 보먼주머니 확장과 세뇨관위축, 세망내피계 활성이 관찰되었다([Fig. 10-l, r, u, A], [Fig. 11-l, r, u, A]).