넙치이리도바이러스 유전자의 K2 region에서 나타나는 반복염기서열의 다양성
Abstract
Various sizes of amplicon were examined in PCR with a single set of primer for K2 region in the gene of Megalocytivirus FLIV-1 (subgroup III) obtained from olive flounder (Paralichthys olivaceus). From sequencing, it was found that each different size of amplicon contained a different number of repetitive genetic elements encoding 43 and 18 amino acids in K2 region. Such genetic polymorphism was maintained in cultivated FLIV-1 in PMF (Pagrus major fin) cell, and after incubation for long time in spleen homogenate. These results suggest that each different sizes of K2 region by different number of repetitive element is present within each separate and distinct viral particle. It is difficult to specify which viral particles, containing the K2 region of a certain length, cause infection first, but it is confirmed that there is a risk of genetic variants of FLIV-1 having various types of genetic characteristics, including polymorphic repeat sequences in the marine ecosystem.
Keywords:
Megalocytivirus, Genetic polymorphism, Flounder lymphocystis iridovirus, Repeat sequence, K2-region, PMF (Pagrus major fin) cellⅠ. 서 론
넙치(Olive flounder, Paralichthys olivaceus)는 우리나라와 일본 중국등의 동아시아에서 상업적으로 매우 중요한 어종이다(Xu et al., 2011). 특히 한국에서는 최근 5년간 양식 어류 총 생산량에서 52%를 차지할 정도로 매우 중요한 어종이다(Statistics Korea, 2008–2012). 그러나 넙치에서 세균성 질병인 Edwardsiella tarda, Streptococcus parauberis, Vibrio harveyi의 감염과 함께 최근에는 바이러성 질병인 Viral Haemorrhagic Septicaemia virus and Megalocytivirus의 감염이 더욱 많은 경제적 손실을 입히고 있다(Park, 2009). 특히 Megalocytivirus의 subgroup III에 속하는 flounder lymphocystis iridovirus (FLIV)는 다른 나라보다는 우리나라의 양식산 넙치에서 많은 피해 발생 보고가 이루어지고 있으며(Do et al., 2005), 최근에는 국내 양식 starry flounder, Platichthys stellatus 에서도 발병하여 대량 폐사를 일으켰다는 보고가 있는 매우 중요한 넙치류의 질병 병원체이다 (Won et al., 2013).
Human gene을 포함한 다양한 종의 진핵세포 gene내의 tandem repeat sequence (TRS)는 유전자 감식, 친자확인, 원산지 또는 품종확인의 유전자 마커로 활용되고 있고, virus gene내의 TRS는 viral genotyping 등에 활용된다(Rita et al., 2010). 수산생물병원체에서는 새우의 대량폐사를 유도하는 WSSV (White spot syndrome virus)가 open reading frame (ORF) 내의 광범위한 TRS가 보고되어 PCR-genotyping 와 ancestor virus의 연구 그리고 바이러스의 국가 간 이동에 대한 연구에서도 이용되고 있다(Dieu et al., 2004).
어류 병원체인 Megalocytivirus가 속하는 Iridoviridae family의 virus 유전자에서 빈번하게 발견되는 환상 변이 (circularly permutated)와 최종 끝 부위 서열이 반복되는 (terminally redundant) 특성은 lymphocysitis disease virus 등에서 보고된 바 있다(Walker et al., 1980; Samalecos et al., 1986). 다만 Megaolocytivirus에서 나타나는 이러한 반복염기배열에 대한 보고는 담수관상어에서 폐사를 유발하며 subgroup II에 속하는 Megalocytivirus PGIV (Pearl gourami iridovirus )에서의 변화는 보고된 바 있으나 (Kim et al., 2011), 우리나라 중요 양식어종인 넙치에서 병원성을 나타내는 subgroup III에서의 보고는 전혀 이루어지지 않고 있다.
그러므로 본 연구는 국내 양식 넙치에서 중요한 병원체인 Megalocytivirus FLIV-1 (subgroup III)의 K2 유전자 부위에서 나타나는 새로운 반복 서열의 확인, 염기 배열의 특성 분석 그리고 반복 pattern의 변화에 의한 genetic polymorphism과 그 생리적 의미를 해석함으로써 우리나라 양식산업에서 가장 중요한 넙치의 생산성 향상에 기여하고자 한다.
Ⅱ. 재료 및 방법
1. 바이러스
2018년 9월 동해안에서 최종 누적폐사율이 약 2%에 달하는 넙치 양식장에서 어체중 80g의 폐사 넙치로부터 채취하였다. 채취된 폐사어의 spleen을 TSA 배지에 imprinting 하였을 때 세균의 감염은 확인되지 않았다. 넙치의 감염은 megalocytivirus의 MCP와 ATPase 유전자를 target으로 하는 PCR (M2F/M2R, 3F/3R) (Oshima et al., 1996, Kurita et al., 1998)에서(<Table 1>), 각각 908 bp와 563 bp 크기의 amplicon 생성 확인을 통하여 감염을 확인하였다. Megalocytivirus IVS-1 (subgroup-I)과 PGIV-1 (subgroup II) strain은 부경대학교 수산생명의학과 진단생화학 연구실로부터 배양 상등액을 협조 받아 사용하였다.
PCR primers used in this study. *Based on the nucleotide sequence of FLIV-1-v1
2. 바이러스 DNA의 분리
Megalocytivirus DNA는 감염 넙치의 spleen 조직 마쇄액 또는 바이러스 감염 세포 상등액으로부터 추출하였다. 조직의 바이러스 DNA 분리는 감염넙치로부터 spleen 10 mg (108.0 copies/mg) 을 채취하여 minihomogenizer를 이용하여 1 ml PBS (pH 7.4)와 함꼐 5분간 마쇄한 조직 마쇄액 (10 μL) 또는 아래에 기술한 바이러스 감염 PMF 세포의 배양 상등액 (100 μL, 108.2 copies/ml)으로부터 AccuPrep Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer, Korea)를 사용하여 제조사의 protocol에 따라 수행하였으며 최종 얻어진 DNA는 100 μL로 하였다. 추출한 바이러스 DNA의 정량은 Quantus Fluorometer (Promega, USA)를 이용하여 수행하였으며 -20℃에 보관하여 실험에 사용하였다.
3. PCR
PCR은 조직 마쇄액 또는 감염 PMF 세포의 배양 상등액으로부터 분리한 바이러스 DNA를 template로 하여 Applied Biosystems 2720 thermal cycler (Applied Biosystems, USA)에서 수행하였다. 분리한 DNA 1 μL를 template으로 하여, 10 mM Tris-HCl (pH 8.5), 40 mM KCl, 1.5 mM MgCl2 200 nM dNTP, 0.1 unit Taq DNA polymerase (Takara Co. Ltd. Jap.) 및 10 pmol primer set (Bioneer, Korea) <Table 1>를 혼합하여 최종 volume 50 μL로 제작하여 PCR을 수행하였다. PCR 증폭반응 조건은 94℃에서 5분간 pre-denaturation 시킨 후, 94℃ 30초 denaturation, 55℃ 30초 annealing, 72℃ 30초 extension의 30 cycles 반응 후 72℃ 7분간 post-extension 시켰다. 증폭된 산물은 0.5 ɥg/mL Ethidium bormide (EtBr)가 첨가된 2% agarose gel (SeaKem LE Agarose, Lonza, Swiss)을 TAE buffer(40mM Tris-acetate, 1 mM EDTA, pH 8.0)상에서 전기영동 후 증폭된 DNA 단편(PCR amplicon)을 확인하였다. 증폭된 DNA의 길이를 측정하기 위한 marker로서 100 bp DNA ladder (Bioneer, Korea)를 사용하였다.
4. 염기서열 결정
전기영동 후 각각의 amplicon band를 cutting 후 QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Germany)를 이용하여 agarose gel로부터 추출하였다. 추출된 DNA amplicon은 pGEM T-easy vector system (Promega, USA)을 사용하여 제조사의 protocol에 따라서 plasmid vector에 삽입하였다. 형질전환된 DH5ɑ (Thermo Fisher Scientific, USA)로부터 QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN, Germany)를 이용하여 제조사의 protocol에 따라 plasmid DNA를 분리하였다. 분리된 plasmid DNA는 Macrogen(Korea)에 의뢰하여 sequencing을 수행하였다. 이와 동시에 분리된 각각의 plasmid는 각각 또는 혼합하여 이를 template로 하는 PCR (primer 1K2F/1K2R)을 실시하여 반복 서열에 대한 PCR의 특이성 확인에 사용하였다.
5. 염기서열의 비교
유전자 염기서열을 비교 분석하기 위해 Macaw program (Version 2.0.2., National Center for Biotechnology Information, National Institutes of Health, USA), BioEdit software (Version 7.0.6., Department of Microbiology, USA) 및 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 Basic Local Alignment Search Tool에 등록된 database 정보를 사용하였다(<Table 2>). 또한 바이러스의 계통발생학적 분석을 수행하기 위해 Mega4 program (Version 4.1, Center for Evolutionary Functional Genomics, USA)을 통해 이들 바이러스 유전자와 NCBI에 등재된 이리도바이러스 strains의 MCP 염기서열을 이용하여 phylogenetic tree를 제작하였다([Fig. 2]).
Comparison of similarities between the MCP and ATPase genes of FLIV-1 to the corresponding sequences of the subgroup representative megalocyteiviruses. *Homology of amino acid sequence deduced from nucleotide sequence
6. 세포 및 바이러스의 배양
감염 넙치 spleen을 Leibovitz medium (L-15, Sigma-Aldrich, USA) 첨가하여 마쇄(1:10, w/v)하고 그 현탁액을 10,000 x g 에서 10분간 원심분리 후 상등액을 0.45 ɥm syringe filter에 통과시켜 접종액을 준비하였다. Fetal bovine serum (FBS, Gibco, USA) 5% 포함된 L-15 medium에서 배양중인 80% confluency를 보이는 PMF cell line (Pagrus major fin cell line, Kwon et al., 2019)에 상기 준비된 접종액 100 μL를 접종하여 25℃ 7일간 배양하며 매일 CPE의 형성를 관찰하였다. CPE 발생을 확인 후 상등액 100 μL를 취하여 새롭게 준비된 PMF cell line에 다시 접종하고 1, 3, 5, 7 그리고 9일째 각각 배양 상등액 100 μL로 부터 바이러스 DNA를 분리하여 K2 region을 target으로 하는 PCR (1K2F/IK2R primer)의 template로 사용하였다.
7. K2 region 부위 variants의 stability
PMF cell에서 9일간 배양 한 FLIV-1 배양 상등액 100 μL (sup-sample) 또는 AccuPrep Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer)를 사용하여 동일 volume의 배양 상등액으로부터 분리한 virus DNA (DNA-sample)를 준비하였다. 그리고 비감염 돌돔 (어체중 30g)의 spleen을 취하여 PBS 10x volume에 마쇄하여 조직 마쇄액을 준비하였다. sup-sample 및 DNA-sample 100 μL 각각을 마쇄액 100 μL에 혼합하여 25℃에서 1분 및 10분 동안 incubation하였다. 각 반응액 100 μL로부터 AccuPrep Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer)을 이용하여 virus DNA를 분리하여 상단에 기술한 방법과 동일하게 K2 region을 target으로 하는 1st PCR (IK2F/IK2R primer set) 및 2nd PCR (IK2F/IK2R 및 IK3F/IK3R primer sets) 을 수행하였다.
Ⅲ. 결 과
1. K2 region에서의 유전적 polymorphism
K2 region을 target하는 PCR (primer 1K2F/1K2R)에서 IVS-1 (subgroup I)은 단일 amplicon을 생성하였으나 subgroup III에 속하는 FLIV-1은 3개의 major amplicon을 생성하는 유전적 polymorphism을 보였다([Fig. 1 (C)]). 그러나 이는 PGIV-1 (subgroup II)이 나타내는 유전적 polymorphism과는 다른 유전적 pattern을 보였다([Fig. 1 (C)]).
![[Fig. 1]](/xml/27051/KSFME_2020_v32n6_1513_f001.jpg "[Fig. 1]")
PCR amplification for MCP (A), ATPase (B) gene and K2 region (C) in different subgroups of megalocytivirus. In each gel, Lane 1 : IVS-1, lane2 : PGIV, lane 3 : FLIV-1.
MCP 및 ATPase gene을 target으로하는 PCR에서는 모두 예상 크기의 단일 밴드가 확인되었으며([Fig. 1 (A), (B)]), 염기서열 분석에서 FLIV-1의 두 유전자는 전체유전자 정보가 알려진 rock bream iridovirus (RBIV, subgroup I, AY532606) 및 infectious spleen and kidbey necrosis iridovirus (ISKNV, subgroup II, AF371960) 과는 각각 약 93∼96%의 상동성을, 그리고 동일 subgroup III 속하는 turbot reddish body iridovirus (TRBIV, subgroup III, GQ273492 / AY590687) 와는 99% 이상의 높은 염기서열 상동성을 보여 주었다 (<Table 2>). 그리고 MCP 유전자 염기서열을 기준으로 한 phylogenetic tree에서 본 연구에서 분리한 FLIV-1은 명확하게 subgroup III임을 확인할 수 있었다([Fig. 2]).
![[Fig. 2]](/xml/27051/KSFME_2020_v32n6_1513_f002.jpg "[Fig. 2]")
Molecular phylogenetic tree by neighbor-joining analysis constructed based on partial nucleotide sequences of MCP gene in various megalocytiviruses including FLIV-1 of this study (National Center for Biotechnology Information). Bootstrap values were obtained from 1,000 replicates, and these values less than 95 were hidden in the tree. The scale bar represents 0.01 nucleotide substitution per site.
2. 반복 염기서열에 의한 K2 region 의 유전적 다양성
K2 region에서 나타나는 3개의 major amplicon을 gel에서 분리하여 염기서열을 분석한 결과 각각 1168 bp, 967 bp 그리고 781 bp (FLIV-1-v1, FLIV-1-v2, FLIV-1-v3)로 나타내었으며 이를 GenBank에 각각 등록하였다 (Accession number : JF918538, JF918539 그리고 JF918540). 이러한 유전적 차이는 K2 region에 존재하는 129 bp (43 amino acids)의 긴 반복서열 (long repeat sequence, LRS)과 54 bp (18 amino acids)의 짧은 반복서열 (short repeat sequence, SRS)의 반복 회수에 의하여 이루어지고 있음을 확인할 수 있었다 [Fig. 3]. 즉 FLIV-1-v1 (1168 bp)으로부터 LRS와 SRS 각각 1 개씩 deletion 되어 FLIV-1-v2(967 bp)가 되며, 다시 한번 이러한 deletion이 연속되어 나타나면 FLIV-1-v3(781 bp)가 되는 것으로 확인되었다. 나타난 RS의 deletion은 nucleotide 숫자에서 3배수 규칙을 따르고 있어 K2 region이 관여하여 생성되는 단백질의 아미노산 숫자에 영향을 주고 있으며 이는 생리적으로 의미를 가지고 있을 가능성을 제시하였다.
![[Fig. 3]](/xml/27051/KSFME_2020_v32n6_1513_f003.jpg "[Fig. 3]")
Comparison of amino acid sequences deduced from repeat sequences in K2 region of FLIV-1 variants (A), TRBIV (GQ273492) (B), PGIV-1 variants (PGIV-1-v2, JF918534; PGIV-1-v4, JF918536; PGIV-1-v5, JF918537) (C), IVS-1 (D). Each number and asterisk at the right-end represents the amino acid length of each variant of K2 region and termination codon, respectively. Gaps and repeat sequences are marked as dashes and boxes, respectively. * termination codon
Multiple band를 보이는 PGIV-1와 단일 band를 보이는 IVS-1 [Fig. 1]의 K2 region에서도 FLIV-1의 LRS 및 SRS 내부에 있는 EEEDEYDCPEYE (12 aa), PPPKRECKKK (10 aa) TTTVAPT (7 aa)와 같은 공통되는 IRS (Intra repeat sequence)를 포함하고 있었으나 FLIV-1의 반복서열과는 다른 반복서열을 가진 것으로 확인되었다([Fig. 1, 3]).
[Fig. 1]에서 나타난 PGIV-1의 multiple band 중 3개를 cloning 하여 염기 서열을 분석한 결과 Kim et al (2011)이 보고한 PGIV-1의 v2, v4, v5 (GenBank accession no. DQ812904, JF918536, JF918537)와 동일하였다.
3. PCR의 특이성 분석
PCR template에 있는 다양한 형태의 RS는 종종 Taq polymerase의 biomistake를 유도하고 이는 비특이적인 amplicon 생성의 원인이 될 수 있다고 알려져 있다 (Jenkins et al., 1996, Wang et al., 2002). 그러므로 FLIV-1의 genetic polymorphism이 RS의 존재로 인한 PCR 증폭과정 중 나타난 오류인지를 확인하기 위해, FLIV-1-v1, FLIV-1-v2, FLIV-1-v3 의 K2-region 각각을 삽입한 3 가지의 재조합 plasmid DNA를 준비하였다. 각 재조합 plasmid DNA 각각과 3가지 plasmid DNA 모두의 혼합한 시료 (총 4 종류) 각각을 template로 하여 PCR을 수행하였을 때 각각은 모두 예측한 크기의 single 또는 3개의 amplicon이 동시 생성된 것을 확인하였다([Fig. 4]). 그러므로 K2 region의 genetic polymorphism은 반복서열에 의하여 발생하는 PCR 오류가 아님을 확인할 수 있었다.
![[Fig. 4]](/xml/27051/KSFME_2020_v32n6_1513_f004.jpg "[Fig. 4]")
PCR specificity for the repeat sequence region cloned into plasmid. Amplicon in PCR targeted K2 region of FLIV designated as FLIV-v1, 2, and 3 were cloned into pUC 18. Puified each cloned plasmid was used as a template for PCR with primer 1K2F/1K2R. Lane 1 : FLIV-1-v1; Lane 2 : FLIV-1-v2; Lane 3 : FLIV-1-v3; Lane 4 : Mixture of three plasmids ; Lane 5 : Purified DNA from tissue infected with FLIV-1.
4. Genetic polymorphism의 수직 전달
바이러스가 복제에 의하여 progeny virus에 대한 유전정보의 수직적 전달에서 나타나는 K2 region의 polymorphism 변화를 관찰하기 위해 in vitro 배양을 수행하였다. Cell에 감염 조직을 식균하고 난 후, 3일째부터 CPE (Cytopathic effect)가 나타나기 시작했고 9일 후에는 대부분의 세포가 사멸되었다([Fig. 5]). 배양된 상등액을 새로운 PMF cell 에 접종 후 1, 3, 5, 7 그리고 9일째 채취한 FLIV-1 유전자 내 K2 region의 polymorphism 은 배양 기간과 상관없이 모두 배양 전 FLIV-1과 동일한 genetic polymorphism을 보여 주었다([Fig. 6]).
![[Fig. 5]](/xml/27051/KSFME_2020_v32n6_1513_f005.jpg "[Fig. 5]")
Cytopathic effect of FLIV-1 in PMF cell. (A), Non-infected PMF; (B), PMF at 9days after inoculation of FLIV-1.
![[Fig. 6]](/xml/27051/KSFME_2020_v32n6_1513_f006.jpg "[Fig. 6]")
Genetic polymorphism in the K2 region of FLIV-1 cultured in PMF cell. Lane 1 : inoculated FLIV-1; Lane 2~6 : FLIV-1 obtained from supernatant of PMF cells at 1, 3, 5, 7 and 9 days post inoculation of FLIV-1.
5. FLIV-1 polymorphic variant의 stability
PCR에서 나타나는 각 K2 region의 polymorphic DNA는 바이러스 capsid 내에 있는지 (variant in virus particle) 또는 단순히 감염 세포내에 DNA 형태로 존재하고 있는지를 분석하기 위해 FLIV-1 감염 세포배양액 또는 purified virus DNA를 조직 homogenate에 각각 spike하고 incubation 한 후 homogenate 내의 virus DNA를 PCR로 확인하였다.
[Fig. 7]에서 보듯이, 분리된 virus DNA는 비감염 조직 마쇄액과 1분 동안의 짧은 반응에서도 K2 region을 target으로 하는 1st 그리고 2nd PCR에서 모두 음성의 결과를 보였다. 그러나 배양 상등액의 바이러스는 비감염 조직 마쇄액과 10분 이상 반응하여도 1st PCR에서 뚜렷한 3개의 major polymorphic DNA 증폭물을 생성하였다. 따라서 순수 분리과정을 거친 viral DNA와는 달리 배양 상등액 내 각기 다른 길이의 K2 region을 포함하는 각각의 viral DNA는 각기 다른 virus capsid 내에서 안정적인 상태에 있음이 확인되었다.
![[Fig. 7]](/xml/27051/KSFME_2020_v32n6_1513_f007.jpg "[Fig. 7]")
Stability of the genetic materials of FLIV variants in the homogenate of spleen from rock bream. FLIV-1 cultured in PMF were mixed in the spleen homogenate of uninfected rock bream as supernatant form (sup-sample) or DNA form that has undergone a DNA purification steps for an sup-sample (DNA-sample). After 1 and 10 minutes incubation at 25℃, virus DNA was purified from the mixture, and 1st (lane 1, 2 for DNA-sample after 1 and 10 min. incubation, respectively) and 2nd PCR (lane 3, 4 for DNA-sample after 1 and 10 min. incubation, respectively) for K2 region was performed. For sup-sample, 1st PCR for K2 region was performed after 1 and 10 min incubation (lane 5, 6 after 1 and 10 min. incubation, respectively).
Ⅳ. 고 찰
최초의 Megalocytivirus의 repeating sequences는 subgroup I에 속하는 red sea bream iridovirus (RSIV)의 complete genomic sequence 분석을 통하여 ribonucleotide reductase small subunit (RNRS) 부위에 매우 짧은 것들이 존재하고 있음에 대한 단순 보고에 의하여 이루어졌다(Kurita et al., 2002).
그런데 최근 Megalocytivirus subgroup I 분석에서 (Jeong et al., 2003) 새롭게 중요 반복 서열 부위로 알려진 것은 Iridovirus의 K2 region이다. 이 부위는 Laminin type epidermal growth factor like (LE) protein을 coding하는 ORF-2 gene 말단의 repeat region으로서 cell adhesion, growth migration, 그리고 differentiation에 중요한 역할을 하여 viral host specificity와 replication 속도와 관련이 있을 것이라 추정되고 있다 (Do et al., 2005).
본 연구에서는 국내 통영 넙치양식장의 감염어로부터 분리된 FLIV-1의 K2 region의 염기배열 분석에서 v1, v2 그리고 v3 라는 major genetic polymorphism을 확인할 수 있었다([Fig. 1, 3]).
생성된 다양한 amplicon의 염기 서열 분석을 통하여 생성된 genetic polymorphism은 RS의 deletion / addition에 의한 것이었음을 확인할 수 있었다([Fig. 3]). 즉 K2 region의 RS에는 43 과 18 amino acids로 구성되는 LRS 와 SRS 2가지가 존재했으며, LRS+SRS를 하나의 unit로 하는 deletion pattern 변화에 의하여 v1, v2 그리고 v3 라는 genetic variant 들로 변화하였다. 이러한 FLIV 에서의 polymorphic variation 변화와 염기 배열 특성에 대한 보고는 세계적으로 본 연구에서 최초로 이루어지는 것이다.
다만 최근에 이러한 RS의 특성 분석은 최근 subgroup II에 속하며 담수관상어 질병 원인체인 PGIV (Pearl grourami iridovirus)에 대한 연구에서도 보고된 바 있으나 그 원인을 단순히 여러 국가로부터 생산된 관상어를 Singapore등의 국제 무역 관상어 집합지에서 혼합하여 각 수입 국가로 배분하는 과정에서 각 지역의 다양한 genetic 특성을 갖는 virus의 multiple infection에 의한 것이라고 추정한 바 있다(Kim et al., 2011).
또한 FLIV를 제외하면 유일한 Megalocytivrus subgroup III의 또다른 species 인 TRBIV의 유전자는 multitype이 아닌 단순히 하나의 full sequence 로서만 보고되어 있으나, 본 연구에서 검토 한 결과 K2 region 에서 FLIV-1-v1과 매우 높은 유사성을 보여주었다. 그러나 K2 region의 첫 번째 LRS는 43 대신에 40 amino acids로 구성되고, SRS 모두는 18이 아닌 17 amino acids로 구성되어 있어 species 간의 특성을 확인할 수 있었다 ([Fig. 3]). (GenBank AY590687).
그러므로 K2 region에서 나타는 Megalocytivirus의 유전적 polymorphism 특성은 3개의 subgroup I, II, III 모두에서 나타나는 EEEDEYDCPEYE (12 aa), PPPKRECKKK (10 aa) TTTVAPT (7 aa)와 같은 공통적 IRS (Intra repeat sequence), 그리고 각 subgroup의 유전적 특성을 나타내는 LRS/SRS와 같은 특이적인 부위로서 구성되어 있음이 확인되었다.
이러한 RS의 분석은 RS를 가지는 cloned plasmid를 template로 한 PCR에서도 동일한 polymorphic 결과를 보여 주어 우리의 결과는 Taq polymerase가 RS에 대하여 나타내는 특성에 의하여 생성된 artifact가 아님을 확인 하였다([Fig. 1, 4]). 또한 검출된 polymorphic DNA는 장시간의 tissue homogenate 내의 DNAse에 (Chakrabarty et al., 1970) 노출되어도 높은 안정성을 보여주어 숙주 세포내에 노출된 형태가 아니라 virus capsid 내에 쌓여져 안정적이고 독립적인 각각의 variants 형태로 존재하고 있음이 시사되었다.
이러한 genetic polymorphism의 다음 virus 세대를 위한 복제, 그리고 숙주의 방어 system이 바이러스의 변이 또는 변이바이러스의 screening에 관여하는지를 분석하기 위하여 PMF cell line을 사용하여 FLIV-1을 in vitro에서 배양하였다. 배양 상등액을 sampling하여 K2 region에 대한 PCR 결과에서 처음 바이러스와 동일한 genetic polymorphism을 확인할 수 있었다([Fig. 6]). 이는 각 RS variant particle은 각각의 특징적 K2 region의 RS 유전적 부위를 다음 세대로 수직적으로 전달될 수 있음을 알 수 있었다([Fig. 6]). 한편 건강한 넙치에 배양된 FLIV-1을 challenge (1x107 copies/fish/돌돔 27.2g 어체중) 하였을 때 7일 후 어류 조직내에서 충분히 검출되었으나 폐사를 유도하지는 못하여, Jung et al.(2016)의 결과와 동일한 결과와 함께 FLIV의 병원성은 Do et al.(2005)에 의하여 보고된 것보다는 낮은 것임을 확인할 수 있었다.
결론적으로 넙치에서 이리도 바이러스 질병의 원인체인 mgalocytivirus FLIV-1 (subgroup III)은 ORF-2 gene내의 RS에서 다양한 유전적 다양성을 갖는 새로운 variant particle로 나아 갈 수 있음을 확인할 수 있었다. 이러한 분석은 향후 넙치 양식 산업에서 Megalocytivirus의 감염을 보다 효과적으로 예방 할 수 있는 기본적인 유전적 연구 결과가 될 것이다.
Acknowledgments
이 논문은 부경대학교 자율창의학술연구비(2019년)에 의해 연구되었음
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