염분 변화에 따른 명태(Gadus Chalcogrammus)의 스트레스 반응; 혈액생리학적 변화 및 유전자 발현

Ⅰ. 서 론

대구과 어류에 속하는 명태(Gadus chalcogrammus)는 우리나라 동해와 일본 북부의 아시아 지역에서부터 오호츠크해, 베링해 및 미국 북부 등 북태평양 지역에 널리 분포하고 있다(Hiatt et al., 2010). FAO에 따르면, 국내 명태의 어획량은 1980년대 연간 7만톤에서 1990년대 6천톤으로 꾸준히 감소하였고, 2000년 이후로는 통계적으로 어획량 기록이 어려울 정도로 급감하였다(FAO, 2021). 국내에서 명태의 급감에 대한 원인으로는 기후변화로 인한 수온 상승과 남획이 주요 원인으로 여겨지고 있으며(Lee and Kim, 2010), 명태의 자원회복을 위해 국내 연구기관에서는 2016년 전주기적 명태 양식에 성공하였다.

염분, 수온, 용존 산소 및 사육 밀도 등의 수질환경은 어류 양식에 있어서 중요한 요인이다(Alderdice and Forrester,1971; Shi etal., 2011). 이전 연구들에 의하면 명태의 서식 수온은 10℃ 이하의 저수온으로, 특히 명태 치어의 적수온은 2에서 7℃ 사이로 알려져 있다(Bakkala, 1993; Nakatani and Maeda, 1984). 따라서 명태 양식에 있어서 수온 유지는 많은 비용 발생이 따른다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 여름철 해수 수온이 높은 시기에 상대적으로 수온이 낮은 지하 해수를 공급해 주는 것이 경제적으로 효율적일 수 있다(Lee, 2015). 그러나 지하 해수는 일반 해수에 비해 염분이 낮고 강우량에 따라 염분 변화가 크기 때문에(Lim et al., 2012) 양식 대상 종의 적정 사육염분 농도에 대한 연구가 필요하다. 해산어에 있어서 사육수의 염분 변화는 어체 내 스트레스 요인으로 작용될 수 있다(Bervoets et al., 1996). 급격한 염분 변화는 삼투압 스트레스로 작용하게 되고 단백질의 구조 변형, DNA 손상 및 지질 과산화 등으로 인하여 세포의 산화적 스트레스를 유발하게 된다(Evans and Kűltz, 2020). 세포 내에서 산화적 스트레스는 활성산소(Reactive oxygen species, ROS)를 발생시키며, 이를 제거하기 위해 항산화효소를 활성화시켜 활성산소를 제거함으로써 세포의 항상성을 유지한다(Martnez-Álvarez et al., 2005). 활성화 된 항산화효소는 산화적 스트레스에 대한 바이오마커로 이용이 되며 (Bansal and Kaushal, 2014), Superoxide dismutase (SOD)는 활성산소에 대항하여 처음 생성되는 항산화효소이다(Nakano et al., 2014).

Cortisol과 glucose는 환경적 스트레스에 노출이 되었을 때, 증가하는 대표적인 생리학적 지표이다(Barton and Iwama, 1991; Pacheco and Santos, 2001). Cortisol은 대사와 삼투압을 조절하는 호르몬으로 전구체인 콜레스테롤로부터 합성이 되며, 스테로이드 합성의 기질로 사용이 되는 Steroidogenic acute regulatory protein (StAR)이라는 단백질이 스테로이드 생성 세포의 미토콘드리아 막을 통해 콜레스테롤 수송에 관여하며 cortisol의 생성은 시작된다(Clark et al., 1994). 정상 상태에서 순환하는 cortisol 농도는 생물학적 기능을 유지하는데 필수적이지만 높은 cortisol 농도는 혈액 내 glucose 농도를 증가시킨다(Samaras et al., 2018). 또한 cortisol은 glucocorticoid receptor (GR)의 작용제로 작용하며, GR은 항상성을 유지하기 위해 chaperone, kinase, phosphatase 및 proteasome 등을 포함하는 수많은 세포질(cytoplasm) 단백질과 상호작용을 하는 유전자의 전사를 조절한다(Heitzer et al.,2007; Krug et al., 2014). Heat shock protein 70 (HSP70)은 대표적인 분자 chaperone으로, misfolding 된 단백질을 refolding 시켜 세포를 보호하는 역할을 한다. HSP70은 박테리아 감염에서부터 열충격, 중금속 노출 및 산화적 스트레스 등 다양한 환경 스트레스에 대항하여 세포를 보호하기 위해 광범위하게 발현된다(Podrabsky and Somero, 2004; Somero, 2010).

다른 스트레스 인자로, 간 기능장애 및 간 손상의 지표로 고려되는 glutamic oxaloacetate transaminase (GOT), glutamic pyruvic transaminase (GPT)는 중요한 아미노기전이효소(Aminotrans–ferases)이다(Wang et al., 2005; Ming et al., 2014). 체내 항상성 유지를 위한 에너지 생성과 관련된 total protein (TP)도 혈중 스트레스 지표로 고려되고 있다(Davis and Parker et al., 1990).

염분에 관한 명태의 연구로는 염분 노출 1일 후 명태 부화자어의 생존율은 34 psu에서 84.1%, 25 psu에서 74.7%, 20 psu에서 56.9%로 보고되었다. 부화율 또한 염분 농도가 낮아짐에 따라 감소하였다(Choi et al., 2020). 그러나 염분 농도에 따른 명태의 생리적 반응이나 자치어를 제외한 성장 단계에 따른 염분의 영향 등에 관한 연구는 보고되어 있지 않다. 따라서 본 연구는 지하 해수 사용 시 낮아지는 사육수의 염분 변화에 의한 명태의 생리학적 변화를 이해하기 위해서 스트레스에 의해 유도되는 지표들을 평가하였으며, 명태 사육을 위한 적정 염분 조건을 규명하고자 하였다.

Ⅱ. 연구 방법

3. StAR, GR 및 HSP70 mRNA 발현 분석

Total RNA 추출을 위해 50 mg의 두신과 간 조직을 균질화하여 Trizol Reagent (Thermo, USA)를 이용하여 추출하였으며, total RNA 순도는 흡광도 206/280 비율이 1.8 이상이 되는 것을 사용하였다. 먼저, RT (Revers tanscriptase)-PCR은 iScript cDNA synthesis kit (Bio-Rad, USA)를 이용하여 각 유전자의 cDNA를 합성하였다. 이후 Primix PCR kit (Enzinomics, Korea)를 이용하여 PCR을 실시하였고 sequencing 통해 각 유전자의 단편을 확인하였다. PCR에 이용된 primer는 이미 알려진 명태의 HSP70 (GeneBank accession No. MF770310.1) 염기서열과 대서양 대구의 GR (GeneBank accession No. JF896315.1) 및 StAR (GeneBank accession No. XM00370229.1) 염기서열에 기초하여 “Primer3” 프로그램을 이용하여 제작하였다(<Table. 1>).

<Table 1>

List of primers used for mRNA expression analysis in walleye pollock

명태의 두신과 간 조직에서 StAR, GR 및 HSP70 mRNA의 발현을 상대정량하기 위해 Quantitative real time-PCR (qRT-PCR)을 실시하였으며, housekeeping gene은 명태에서 알려진 18s rRNA (GeneBank accession No. AB16661.1)를 이용하였다. TOPreal™ SYBR Green qPCR PreMIX Kit (Enzynomics, Korea)를 이용하여 0.25 µM의 SYBR Green을 포함한 각 20 µL 반응산물은 Applied Biosystems 7500 (Thermo, USA) 장비에서 95℃에서 10 min 반응 후 95℃ 10 sec, 52℃ 15 sec, 72℃에서 15 sec를 40회 반복하였다. 모든 샘플은 두 번 반복하였으며, 2−∆Ct 방법에 따라 데이터는 분석하였다.

Ⅲ. 연구 결과

1. Hematocrit (Ht) 및 Hemoglobin (Hb)

사육수의 염분 변화에 따른 Ht와 Hb 변화를 [Fig. 1]에 나타내었다. 34 psu에서의 Ht 값은 28 ± 2%로 30 psu에서 27 ± 1%와 큰 차이를 보이지 않았으나, 20과 15 psu에서는 37.5 ± 2.5%로 사육수의 염분이 낮아질수록 Ht 값은 점차 증가하는 경향이 나타났다([Fig. 1A]).

[Fig. 1]

Levels of A: Ht, and B: Hb in plasma of walleye pollocks exposed to different salinity. Values are presented as the mean ± standard deviation (n = 3). Each experiment was performed in triplicate. Different letters indicate significant differences (p < 0.05).

Hb은 34 psu에서 5.5 ± 0.0 g/dL, 25 psu에서 6.35 ± 0.05 g/dL로 증가하는 경향을 보였고, 15 psu에서는 5.85 ± 0.75 g/dL로 낮아지는 수치를 보였으나 통계적으로 유의차는 나타나지 않았다([Fig. 1B]).

2. GOT, GPT 및 TP

GOT 농도는 34 psu에서 32.0 ± 0.58 U/L로 가장 낮았고, 20 psu와 15 psu에서는 각각 42.3 ± 2.60 U/L와 46.7 ± 2.19 U/L로 나타났으며, 염분이 낮아지면 혈액 내 GOT 농도는 증가하는 경향을 보였다([Fig. 2A]). GPT 농도는 34 psu에서 5.0 ± 0.00 U/L였고, 15 psu에서는 7.3 ± 1.20 U/L로 나타나 사육수의 염분이 낮아질수록 점차 증가하는 경향을 보였지만 염분 농도에 따른 유의차는 나타나지 않았다([Fig. 2B]). TP는 25 psu에서 5.9 ± 0.61 g/dL로 가장 높은 농도가 나타났고, 34 psu는 4.46 ± 0.23 g/dL이고 15 psu에서 4.73 ± 0.09 g/dL로 나타났다([Fig. 2C]).

[Fig. 2]

Levels of A: GOT, B: GPT, and C: TP in plasma of walleye pollocks exposed to different salinity. Values are presented as the mean ± standard deviation (n = 3). Each experiment was performed in triplicate. Different letters indicate significant differences (p < 0.05).

3. Cortisol, Glucose 및 SOD 활성

혈장 cortisol, glucose 농도 및 SOD 활성은 [Fig. 3]에 나타내었다. Cortisol 농도는 34 psu에서 790.00 ± 38.39 ng/mL로 가장 낮았으며, 25 psu에서 882.73 ± 32.73 ng/mL로 급격히 증가하며 15 psu에서 888.08 ± 22.84 ng/mL로 가장 높은 농도를 보였다([Fig. 3A]). Glucose 농도는 34 psu에서 41.67 ± 1.2 ng/dL로 가장 낮았으며, 25 psu에서 67.67 ± 11.6 ng/dL로 증가하였고, 15 psu에서 69.34 ± 4.98 ng/dL로 가장 높은 농도가 나타났다([Fig. 3B]). 염분 변화에 따른 명태의 SOD 활성은 34 psu에서 2.68 ± 0.14 U/mL로 가장 낮았으며, 염분이 낮아질수록 증가하는 경향을 보여 15 psu에서 3.51 ± 0.13 U/mL로 가장 높게 나타났다([Fig. 3C]).

[Fig. 3]

Levels of A: Cortisol, B: Glucose, and C: SOD in plasma of walleye pollocks exposed to different salinity. Values are presented as the mean ± standard deviation (n = 3). Each experiment was performed in triplicate. Different letters indicate significant differences (p < 0.05).

4. StAR, GR 및 HSP70 mRNA 발현

염분 변화에 따른 StAR, GR 및 HSP70 mRNA의 상대적 발현은 [Fig. 4]에 나타냈다. 명태의 두신과 간에서 StAR mRNA 발현은 사육수의 염분이 낮아질수록 증가하였다([Fig. 4A와 B]). 두신의 StAR mRNA 발현은 15 psu에서 4.08 ± 0.11로 가장 높게 나타났으며, 간에서는 20 psu에서 0.12 ± 0.11로 가장 높게 나타났다. 명태의 두신과 간에서 GR mRNA 발현은 염분이 낮아질수록 감소하는 경향을 보였다([Fig. 4C와 D]) 두신에서의 GR mRNA 발현은 34 psu에서 0.4 ± 0.00로 가장 높았으며, 15 psu에서 0.21 ± 0.01로 가장 낮았다. 간에서 GR mRNA 발현 또한 34 psu에서 0.42±0.01로 가장 높았으며 15 psu에서 0.22 ± 0.00으로 가장 낮은 발현을 나타냈다. 명태의 두신과 간에서 HSP70 mRNA의 발현 변화는 염분이 낮아질수록 증가하였다([Fig. 4E와 F]). 두신과 간은 34 psu에서 각각 56.77 ± 1.29와 34.89 ± 1.33으로 가장 낮은 발현을 보였으며, 15 psu에서 두신은 126.96 ± 4.63이고, 간은 76.21 ± 2.65으로 가장 높은 mRNA 발현을 나타냈다.

[Fig. 4]

StAR, GR, and HSP70 mRNA expression levels in walleye pollock based on water salinity. A: StAR in head-kidney, B: StAR in liver, C: GR in head-kidney, D: GR in liver, E: HSP70 in head-kidney, and F: HSP70 in liver. For walleye pollocks exposed to different salinity, samples were collected from the head-kidney and liver tissues. Different letters indicate a significant difference (p < 0.05). Data are presented as the mean ± standard deviation (n = 3). Each experiment was performed in triplicate.

Ⅳ. 고 찰

본 연구는 염분 스트레스에 따른 명태의 생리적 변화를 이해하기 위해서 혈액 내의 스트레스 지표들과 관련 유전자들의 mRNA 발현 수준을 조사하였다.

일반적으로 Ht와 Hb는 생체 내 산소 운반능력을 나타내는 생리학적 반응을 나타내는 지표로 알려져 있으며, 이전 연구들은 염분, 수온, 수질오염 등 다양한 스트레스 환경에서 혈액 내 Ht와 Hb의 변화를 보고하였다(Houston, 1997; Hosseini et al., 2011; Park and Min, 2018). 본 연구에서 Ht 값은 20 psu에서 유의하게 증가하였는데, 혈액에서 적혈구의 비율을 나타내는 Ht 값의 증가는 혈액 내 혈당 증가를 의미한다. 따라서 명태는 20 psu 이하의 염분에 노출이 되면 혈당이 증가하고 혈액 내 적혈구 비율이 증가하는 것으로 보인다. Hb의 농도는 염분이 낮아지면 증가하는 경향이 보였으나, 단기간의 염분 스트레스에 노출 시 급격한 변화는 없었다.

GOT와 GPT는 간 기능 및 간 손상의 지표로 고려되며 주로 척추동물의 간세포에 존재하고 어류에서는 간과 비장 세포에 많이 분포하고 있다(Kang et al., 2007). GOT와 GPT 같은 아미노기전이효소는 정상적인 상태에서는 세포 내에 존재하지만 스트레스 환경에 노출이 되면 세포 내의 효소를 방출하여 혈액 내 농도가 증가한다고 알려져 있다(Smith and Romas, 1980). 본 연구에서 GOT는 20 psu에서 유의적인 차이를 보이며 증가하였다. GPT 또한 염분이 낮아질수록 증가하는 경향을 보였으나 유의차는 나타나지 않았다. 이러한 결과는, 낮은 염분에 노출된 조피볼락(Sebastes schlegli)과 염분 농도에 따른 굴(Crassostrea gigas)에서 혈장 GOT의 농도 증가를 보고한 이전 연구들과 비슷한 결과를 나타내었다(Wickes and Morgan, 1976; Oh et al., 2014).

Byrne et al. (1989)의 보고에 의하면 경골어류에서 TP는 간 손상의 지표로 알려져 있다. 본 연구에서 TP 농도는 25 psu에서 증가 후 다시 감소하였는데, 염분 스트레스에 의해 TP 농도는 증가하지만, 염분 농도가 더 낮아지면 간 기능의 저하로 에너지 생성이 감소하고 스트레스에 저항 능력이 감소하는 것으로 보인다. 따라서 본 연구에서 명태는 25 psu 이하의 염분에서는 간 기능 장애를 나타낼 수 있는 가능성을 시사한다.

Cortisol과 glucose는 어류의 대표적인 스트레스 지표이다(Barton et al., 1986; Barton and Iwama, 1991). 본 연구에서 명태의 혈장 cortisol 농도는 염분이 낮아질수록 증가하는 경향을 보여주며, 25 psu에서부터 유의차가 나타났다. Glucose도 cortisol과 함께 증가하였는데 25 psu에서 15 psu까지 비슷한 수준을 유지한다. Choi et al. (2006)에 따르면 감성돔(Acanthopagrus schlegeli)을 10 psu의 저염분에 24시간 노출시켰을 때 glucose 농도가 유의적으로 증가했다는 연구 결과를 보고하였으며, 넙치(Paralichthys olivaceus)와 조피볼락(S. schlegeli) 등에서도 본 연구 결과와 비슷한 경향을 보여주었다(Chang et al., 2002; Min et al., 2014). 이러한 결과는, 명태가 염분 스트레스에 노출이 되면 혈액 내 catecholamine과 corticosteroid의 빠른 교환이 나타나 cortisol 농도를 증가시키며, 간에서 gluconeogenesis가 어려워지고 혈액 내 glucose 농도는 증가하는 것으로 보인다(Cowey and Walton, 1989).

본 연구에서 SOD 활성은 사육수의 염분이 낮아질수록 증가하는 경향을 나타내었으며, 15 psu에서 가장 높은 활성이 나타났다. 염분 스트레스에 따라 생성되는 활성산소를 제거하기 위해 SOD 활성을 증가하여 항상성을 유지하는 것으로 보인다. 이전 연구에서 병어(Pampus argenteus)는 낮은 염분에서 노출 시간이 증가함에 따라 SOD 활성이 증가하였으며(Fei et al., 2011), 철갑상어(Acipenser naccarii)를 담수에 20일간 노출시켰을 때 SOD 활성이 증가했다는 연구가 보고되었다(Álvarez et al., 2002).

StAR 단백질은 스테로이드 생성 속도를 조절하므로, StAR 단백질의 발현량으로 인해 스테로이드 호르몬 합성이 영향을 받는다(Stocco, 2000). 본 연구에서 StAR mRNA 발현은 염분이 낮아질수록 증가하였으며, 25 psu에서부터 발현량이 급격히 증가했다. Juan et al. (2008)의 연구에 의하면, 귀족돔(Gilthead seabream)의 경우 만성 스트레스에서 StAR의 발현이 cortisol과 함께 증가함을 보고하였다. 반면에 본 연구에서 GR mRNA의 발현은 염분이 낮아질수록 감소하였으며 25 psu에서부터 유의차를 보였다. 이러한 결과는 cortisol을 처리한 무지개송어에서 cortisol이 증가함에 따라 GR mRNA의 발현이 감소한다고 (Mathilakath et al., 2003; Park et al., 2011) 보고한 이전 연구 결과와 유사한 경향을 나타낸다.

HSP70은 다양한 환경 스트레스에 노출이 되면 높은 발현을 나타내어 세포 방어, 형태 변형 및 분자 chperone으로 단백질의 refolding에 관여한다(Basu et al., 2002). 본 연구에서 HSP70 mRNA 발현은 염분이 낮아질수록 증가하며, 15 psu에서 가장 높은 발현을 나타냈다. 염분 스트레스에 대한 HSP70의 연구들은, 무지개송어(Oncorhynchus mykiss), 참담치(Mytilus coruscus) 및 오만둥이(Styela plicate)에서 염분 변화에 따라 HSP70 mRNA의 발현이 증가하였음을 나타냈으며, 다양한 수산생물에서 HSP70에 대한 연구들이 보고되어져 왔다(Hosseini et al., 2011: Pineda et al., 2012; Kim and Kang, 2015).

결론적으로 염분 변화에 따른 스트레스 지표들을 종합해 보면 명태는 30 psu까지 염분에서는 생리적으로 안정한 상태로 보이며, 25 psu 이하의 염분에서 Ht, cortisol, glucose, SOD 및 GOT의 변화가 나타났고, StAR, GR 및 HSP70 mRNA의 발현에서도 유의적인 차이가 나타남에 따라 일정 수준 이하의 염분은 명태에게 스트레스 요인으로 작용하는 것으로 보임다. 그러나 본 실험에서는 염분 스트레스에 따른 폐사는 발생하지 않았으며 각 염분 농도에서 24시간 노출 후의 생리적 반응에 대한 조사를 하였기 때문에 급성 염분 변화에 대해서 15 psu까지는 항상성을 유지하는 것으로 보인다. 장기간의 만성적 염분 스트레스 및 자치어 단계를 포함한 성장 단계에 따른 염분 스트레스에 대한 생리적 반응에 대한 연구는 아직까지 이루어지지 않았으며 향후 안정적인 명태 사육을 위해서는 염분 농도에 따른 더 세분화 된 연구가 필요할 것으로 여겨진다. 따라서 본 연구 결과는 염분의 영향에 따른 명태의 생리적 반응 및 분자생물학적으로 염분 스트레스를 이해하는데 기초 자료로 활용될 것이라 기대한다.

Acknowledgments

이 논문은 2022년도 국립수산과학원 수산과학연구사업 동해 특산품종 양식기술개발(R2022003)의 지원으로 수행된 연구입니다..

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