북방전복(Haliotis discus hannai)의 급성 고수온 스트레스에 관한 전사체 분석

Ⅰ. 서 론

북방전복(Haliotis discus hannai)은 원시복족목 (Order Archaeogastropoda) 전복과(Family Haliotidae)에 속하는 연체동물로 한국, 일본, 중국 연안에 분포하는 한류계 전복이다. 참전복으로 불리기도 하는 북방전복은 동아시아 국가에서 상업적으로 소비가 되며, 활발하게 양식산업이 이루어지고 있다 (Sukhan et al., 2022). 북방전복은 산업적으로 중요한 고부가가치 양식생물 종으로 지속적으로 생산량이 증가하고 있는 추세이며, 2021 기준 23,074톤 양식되었고 생산금액은 6,937억 원이었다(KOSIS, 2021). 북방전복의 최적 수온은 약 20 °C로 이 수온을 벗어나면 면역력 감소 및 질병 취약성이 증가되어 폐사율이 높아지는 것으로 보고되어있다(Yu et al., 2021). 전복과 같은 복족류는 이동이 제한적이므로 급격한 환경변화에 노출될 경우 어류보다 심각한 영향을 받는다. 수온 상승은 호흡과 대사를 억제하여 생체 내 에너지 불균형을 유발시키며, 수온 변화는 성장률 감소 및 폐사율 증가를 초래한다(Hoegh and Bruno, 2010; Zhang et al., 2022). 최근 기후변화에 따른 해양의 지속적인 수온 상승은 성장과 생존에 많은 영향을 미치고 있으며, 양식산업에 막대한 손실을 초래하는 환경요인 중 하나이다. 생산량의 현저한 증가에도 불구하고 최근 전복양식은 고수온에 따른 환경변화로 인해 전복의 집단 폐사와 같은 중요한 문제에 직면해 있어 이에 대한 대책 마련이 고수온에 대비하기 위해 내열성 유전자의 발현 기작을 연구하는 것이 중요하게 되었다.

차세대 염기서열 분석기(Next Generation Sequencer, NGS)를 통한 유전체 서열연구가 활발히 진행되어 기능 유전체학(functional genomics)을 통한 발현유전자 연구에 중요한 유전자원이 되고 있다(Werner, 2010). 일반적으로 전사체 분석 기술은 특정 스트레스 반응에 관여하는 전사체의 식별을 용이하게 하고 전사체의 풍부도를 기반으로 유전자 발현을 정량화 하는데 사용된다 (Mortazavi et al., 2008). 북방전복에서 스트레스 관련 연구는 열 내성 관련 genome-wide association study (GWAS) 연구, 삼배체 전복 치패의 고수온 및 저산소 노출에 따른 전사체 분석, 수온 스트레스 노출에 따른 북방전복의 전사체 분석에 대한 연구가 진행되었다(Chen et al., 2019; Kim et al., 2021; Kyeong et al., 2020; Shin et al., 2021; Yu et al., 2021). 하지만 고수온 스트레스에 노출 시간에 따른 북방전복의 유전자 반응 비교 분석과 관련된 정보는 제한적인 실정이다.

따라서 본 연구에서는 NGS 방식으로 RNA sequencing을 진행하여 대량의 전사체를 분석하여 고수온 노출 시간에 따른 북방전복의 전사체 추정 및 관련 유전자 그룹의 발현 패턴을 확인하고 전복의 생리적 메커니즘 변화를 이해하여 고수온에 노출된 전복의 생리학적 지표설정의 기초자료로 활용하기 위하여 진행하였다.

Ⅱ. 연구 방법

Ⅲ. 연구 결과

1. RNA-sequencing 결과

고수온에 노출된 전복의 전사 변이를 비교하기 위해 고수온에 노출시킨 전복의 발 탈락여부로 두 가지 그룹 (Heat sensitive 그리고 Heat tolerant)으로 구분하였으며 혈구조직을 사용하여 RNA-sequencing 분석을 수행하였다. 각 처리구의 분석은 3 반복으로 진행되었으며, 결과를 <Table 1>에 나타내었다. RNA‐seq 결과 132,199,030 transcriptome short reads (16,586,225,560 bp)가 생성되었으며, 평균 길이는 125.59 bp로 나타났다. Raw read에서 adaptor 서열 및 quality가 낮은 서열을 제거하는 trimming 과정을 통하여 clean reads를 생성하였다. Trimmed reads/total length of raw reads는 78.94 %로 나타났다. 결과적으로 reference genome 서열에 trimmed read를 mapping하여 발현값을 계산하였으며, 평균적인 mapping rate는 약 88. 9%로 나타났다(<Table 2>). Mapping은 HISAT 소프트웨어를 사용하여 진행하였다.

<Table 1>

Raw and trimmed data exposed to acute thermal stress (34 ℃) at 3 and 8 hours

<Table 2>

Statistics of reads mapping to reference genome of Haliotis discus hanai

2. Differential expression genes (DEG) 선발

DEG 선발은 log2FC (fold change) > 1 and padj (adjusted p‐value) < 0.05를 사용하여 수행하였으며, log2FC 값이 1보다 크면 상향 조절로, log2FC 값이 - 1 이하이면 하향 조절로 각각 구분하였다. 각 그룹 간 비교하여 선발된 DEG의 수는 [Fig. 1]에 나타냈으며, 상향 조절 유전자 195개, 하향 조절 유전자 512개가 선발되었다. 그 중 functional description을 가진 유전자는 상향 조절에서 168개, 하향 조절에서 456개가 각각 확인되었다(<Table 3>).

[Fig. 1]

(A) MA-plot to show genes in Pacific abalone (3 h vs. 8 h treatment). Horizontal lines highlight ±2 log fold changes, and red plots represent up-regulated genes in the heat treated group; green plots represent down-regulated genes in the heat treated group (B) The number of significantly expressed up-regulated and down-regulated genes.

<Table 3>

Total number of annotated DEGs

3. Functional annotation

DEG의 기능을 이해하기 위하여 GO(Gene Ontology) term enrichment 분석을 수행하였다. GO term은 Biological Process (BP), Cellular Component (CC), 그리고 Molecular Function (MF), 세 가지 독립적인 범주로 표시하였다. GO 분석 결과 상향 조절에 관여하는 DEG는 Biological Process (BP) 401개 유전자, Cellular Component (CC) 619개 유전자, Molecular Function (MF) 40개 유전자가 관여하는 것으로 나타났으며, 하향조절에 관여하는 DEG는 Biological Process (BP) 332개 유전자, Cellular Component (CC) 943개 유전자, Molecular Function (MF) 391개 유전자가 관여하는 것으로 나타났다([Fig. 2]). 그룹을 비교하여 상향/하향 조절 유전자의 항목을 백분율로 나타냈으며, 상향 조절에 관여하는 DEG는 Biological Process (BP)에서 cellular nitrogen compound metabolic process가 11.2%, Cellular Component (CC)에서 intracellular anatomical structure가 15%, Molecular Function (MF)에서 structural molecule activity 52.5%를 차지하였으며, 하향조절에 관여하는 DEG는 Biological Process (BP)에서 regulation of cellular metabolic process가 20.2%, Cellular Component (CC)에서 intracellular anatomical structure가 21.8%, Molecular Function (MF)에서 protein binding이 22.6%를 차지하였다.

[Fig. 2]

Significantly (p > 0.05) differentially expressed genes in heat treatment were grouped in different sub-categories (A) up-regulated; (B) down-regulated

4. 유전자의 그룹간 발현 비교

두 가지 실험구에서 각각 평균 read count를 측정하여 HT그룹을 기준으로 하여 유전자의 차등발현 값을 비교했을 때 상향조절 유전자의 경우 transcriptional regulator ATRX-like가 log2FC 값 5.78로 가장 높게 나타났으며, 하향 조절의 경우 PREDICTED: uncharacterized protein LOC109617406가 –7.83으로 가장 높게 나타났다(<Table 4>).

<Table 4>

Gene expression value of genes in heat sensitive and heat tolerant groups

열 충격 단백질 발현 값을 비교하였을 때 HSP90의 경우 HS 그룹에서 64,594, HT 그룹에서 22,649 발현되었으며 log2FC 값은 – 1.51, HSP60의 경우 HS 그룹에서 420, HT 그룹에서 94로 log2FC 값이 - 2.16 발현되었다. 그리고 sHSP26의 경우 발현 값이 HS 그룹에서 92,906, HT 그룹에서 29,105으로 log2FC 값이 - 1.67로 나타났다(<Table 5>).

<Table 5>

Gene expression value of heat shock protein genes in heat sensitive and heat tolerant groups

Ⅳ. 결 론

수온은 수중 생물, 특히 패류의 서식 환경에 영향을 미치는 중요한 환경 인자로 알려져 있다(Khan et al., 2020; Nie et al., 2020; Xu et al., 2020; Zhang et al., 2022). 고수온은 여름철 전복 폐사의 주 원인 중 하나로 전복 양식의 가장 큰 문제점으로 손꼽히며 관련 연구가 활발히 수행되고 있다. 선행연구에서 수온별 33℃에 노출시켰을 때 전복의 발 탈락률이 급증한다는 연구 결과를 확인하였다(Yu et al., 2021). 본 연구에서는 스트레스 조건을 34℃를 선택하여 NGS를 이용한 고수온 노출 시간에 따른 북방전복의 전사체 분석을 실시하였다. 전복의 부착능력은 온도에 영향을 받는 것으로 보고되어 있다(Park et al., 2015). 전복의 부착능력은 중요한 요건이며 기질에 부착하여 있는 부착지속시간은 전복의 저산소 내성 연구에서 생존기간과 높은 상관관계를 보여 유용한 지표가 되는 것으로 밝혀졌다(Chen et al., 2020). 본 연구에서는 34℃에 전복을 노출 시켰을 때 3시간 이후부터 발 탈락률이 증가하였으며, 이 그룹을 Heat sensitive 그룹, 8시간 노출 경과 후 발이 탈락한 그룹을 Heat Tolerant 그룹으로 구분 지었다. 이는 33℃에 노출 시킨 전복의 발 탈락률 연구와 유사한 결과를 보였다(Yu et al., 2021). 살아있는 샘플을 이용한 sequencing 조건을 충족시켜 고품질의 DNA를 얻기 위해 생존 시간이 아닌 부착 시간을 기준으로 사용하였다. 34℃에 노출된 전복의 발 탈락 시간대에 따라 각 두 그룹을 구분하여 샘플링을 진행하였다. 전사체 분석 결과 그룹 사이에 차등 발현을 가진 유전자는 상향 조절 유전자 195개, 그리고 하향 조절 유전자 512개가 확인되었으며, 그중 기능을 가진 유전자는 상향 조절 168개, 그리고 하향 조절에서 456개가 확인되었다. GO 분석 결과, 두 그룹 사이에서 상향 조절 유전자는 Biological Process (BP)에서 cellular nitrogen compound metabolic process가 11.2 %로 우위를 차지했으며, 이는 세포 내 다양한 유기 및 무기 질소 화합물과 관련된 화학 반응 및 경로에 관여하는 것으로 알려져 있다. cellular component에서 intracellular anatomical structure 관련 유전자가 93개로 가장 우위를 차지하고 있었으며, Molecular function 카테고리에서는 structural molecule activity가 52.5 %, 그리고 structural constituent of ribosome이 47.5 %로 나타났다. 하향 조절 유전자는 Biological Process (BP)에서 regulation of cellular metabolic process가 20.2%로 우위를 차지하였으며 이는 세포의 화학반응 및 경로의 빈도, 속도, 또는 범위의 조절 기능을 하는 것으로 알려져 있다. cellular component에서 상향 조절과 마찬가지로 intracellular anatomical structure 관련 유전자가 206개 (21.8 %)로 가장 우위를 차지하고 있었고 이는 세포 내 핵과 세포질에 관여하는 것으로 알려져 있다. Molecular function 카테고리에서는 binding이 200개 (49.1 %)로 가장 우위를 차지하고 있었으며, 그다음으로 protein binding이 92 (22.6 %)개로 나타났고 이는 다른 분자와 상호작용에 관여하는 것으로 알려져 있다. 북방전복의 이배체와 삼배체 전복을 수온 스트레스에 노출 후 전사체 분석을 실시한 결과에서 Molecular function 카테고리에서 binding이 상위를 차지하는 것으로 나타나 본 연구 결과와 비슷한 패턴이 보고되었다 (Kim et al., 2021). 북방전복 육종전복에서는 protein folding과 protein refolding이 상위를 차지하는 것으로 나타났다 (Shin et al., 2021). 열 충격 단백질 유전자 그룹의 경우 HS 그룹에서 보다 HT 그룹에서 유전자의 발현 값이 하향 조절 된 것으로 나타나 유의미한 차이를 보였다. 선행 연구에서 북방전복이 다른 낮은 온도에서보다 30 ℃에 노출되었을 때 발현이 높게 나타났으며, HSPs 발현이 높게 나타났으며, 특히 북방전복에서 sHSP26의 경우 30 ℃에 노출 후 시간이 경과함에 따라 혈구 조직의 발현이 감소하는 것으로 나타났다 (Shin et al., 2021). 또한 진주조개에서 HSP90 유전자의 발현이 29 ℃에 노출 후 12시간 경과 후 최저 값을 보였다 (Zhang et al., 2022). 이 연구 결과는 인위적인 고수온 스트레스 노출 시간에 따른 유전자 발현 연구의 기초자료를 제공함으로써 북방 전복의 열내성 관련 분자 메커니즘에 대한 이해를 촉진할 것이다. 향후 고수온 노출 시간대별 관련 특이적인 발현 양상을 보인 유전자의 mRNA 발현 및 추가적인 기능을 분석하는 연구가 필요할 것으로 사료된다.

Acknowledgments

이 논문은 2023년도 해양수산부 재원으로 해양수산과학기술진흥원의 지원을 받아 수행된 연구임(20180375, 정자동결보존법을 활용한 전복 양식생산기술개발)

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