강도다리(Platichthys stellatus) Nuclear factor interleukin 3 regulated protein (NFIL3) 유전자의 분자생물학적 특성 및 발현분석

I. 서 론

강도다리(Platichthys stellatus)는 가자미목(Pleuronectiformes) 가자미과(Pleuronectidae)에 속하는 어류로서 일반적으로 몸길이가 30~40 cm 정도로 자라며, 수심 80~350 m 정도의 부드러운 모래질이 분포한 해역에서 많이 잡힌다. 염분 변화에 대한 적응이 빨라, 기수 지역에서도 관찰되며 주로 12월에서 1월 사이에 산란한다. 겨울철 저수온기에서도 먹이 섭취활동이 왕성하여 육성기부터 성어기까지 지속적인 소비가 가능하기 때문에 국내에서 각광받는 어종이다. 특히, 우리나라 연안 해수 수온이 15℃ 이하의 저수온 기간이 길고 담수 유입이 잦은 환경임을 고려할 때 염분 내성과 질병 저항성이 강한 강도다리는 국내 양식 대상 품종이다(Orcutt,1950; Kramer et al., 1995; Shin et al., 2019). 양식 산업에서 강도다리의 중요성이 증대되고 있음에도 불구하고 각종 질병 및 감염에 대한 강도다리의 면역 반응에 대한 기초연구는 부족한 실정이다. 따라서 면역 관련 유전자의 발현 양상을 분석하는 것은 필수적이다(Sohn et al., 2022).

어류는 하등 척추동물로서 무척추동물과 고등 척추동물 사이에 위치하고(Bergliot et al., 2006), 이들의 면역체계는 대식세포와 과립구 등에 의한 비특이적 면역과 림프구에 의한 특이적 면역체계를 가지고 있다. 특히 어류는 비특이적 면역체계가 비교적 발달하고 많은 비중을 차지하고 있다. 비특이적 면역체계의 사이토카인은 세포가 세포를 활성화시키는 단백질이며 면역 반응과 조혈 기능, 조직 회복, 세포의 발달과 성장 등에 중요한 기능을 하며, 항원에 대한 항체 생산을 유도하고, 방어체계를 제어하는 역할을 수행한다(Sohn et al., 2020). 사이토카인에 포함된 interleukin (IL)은 백혈구 및 일부 다른 체세포에서 발현되고 분비되는 사이토카인 그룹이다. 면역계의 기능은 주로 interleukin에 의존하며, 일부 interleukin의 결핍은 모두 자가 면역 질환 또는 면역 결핍 질환을 특징으로 한다. 대부분의 interleukin은 단핵구와 대식세포, 내피세포를 통한 보조 T세포 합성으로 T세포, B세포, 조혈 세포의 발달과 분화를 촉진한다(Brocker et al., 2010). Interleukin 3 (IL-3)는 과립구와 대식세포의 생산과 분화, 기능을 조절함으로써 조혈을 조절하는 사이토카인이다(Dorssers et al., 1987).

Nuclear factor interleukin 3 regulated protein (NFIL3)은 B세포 조절과 적응 면역에 영향을 주는 T세포에서 IL-3 promoter의 전사 활성화제로(Zhang et al., 1995; Kashiwada et al., 2010), 선천성 림프구 세포의 분화를 조절함으로써 선천 면역에 중요한 역할을 한다(Yu et al., 2014). E4 binding protein 4 (E4BP4)라고도 하는 NFIL3는 세포 생존과 사멸, 항염증 반응, 생물학적 주기의 변동 메커니즘을 포함한 필수적인 조절 분자이다(Cowell., 2002). 포유류의 pro-B 림프구에서 NFIL3는 anti-apoptotic effector로 기능하며, 유도된 NFIL3의 발현은 pro-B 세포의 생존을 도와 면역 반응에서 외부로부터 침입하는 항원에 대항하여 항체를 만들어 낸다(Ikushima et al., 1997).

Scylla paramamosain (Mud crab)과 Ctenopharyngodon idella (Grass carp)를 대상으로한 이전 연구에서도 Vibrio alginolyticus와 Aeromonas hydrophila 인위감염 후 NFIL3가 상향 조절되었음을 통해 NFIL3가 병원체 침입에 대한 면역 반응에 영향을 주는 것을 확인하였다(Gu et al., 2019; Yu et al., 2014a). 무척추동물과 경골어류에서 병원체 감염 후 NFIL3의 유전자 발현 분석 연구가 수행되었지만, 국내 양식 대상 품종인 강도다리에서는 연구가 수행되어진 바가 없다. 따라서 강도다리에서 NFIL3의 면역 기능과 분자적 특징에 대한 추가 연구가 필요하다.

이번 연구에서는 염분 내성과 질병 저항성이 강한 강도다리로부터 NFIL3 유전자를 분리 및 동정하여 분자적 특징에 대해 확인하였으며, 정상 어체에서 PsNFIL3 (Platichthys stellatus) 유전자의 조직 특이적 발현 분석과 강도다리 양식 산업에서 막대한 피해를 주는 Viral Hemorrhagic Septicemia Virus (VHSV)와 Streptococcus parauberis (S. parauberis) PH0710를 인위감염시킨 후 조직별 유전자 발현양상을 확인하였다.

Ⅱ. 연구 방법

3. 유전자 발현분석

건강한 상태의 강도다리와 병원체별 인위감염 시킨 후 강도다리의 주요 조직 내 PsNFIL3의 발현 수준을 확인하기 위해 적출한 조직으로부터 total RNA를 분리하고 cDNA로 합성한 후 Quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR)을 이용하여 mRNA의 발현 수준을 측정하였다.

가. 정상 어체에서의 조직별 발현분석

① 실험어 및 감염 병원체

실험에 사용한 실험어인 강도다리는 평균전장 21.5 ± 1.3 cm와 평균체중 128.7 ± 18.2 g으로 경상북도 포항시 소재의 양식장에서 100마리를 구입하여 실험실의 수조에서 2주간 순치시켰고, 인위감염을 위해 17 ± 1℃와 25 ± 1℃로 각각 나누어 추가 순치시켰다. 인위감염 실험에 사용 전 무작위로 3개체씩 선발하여 임상학적 검사를 수행하여 건강성을 확인한 후 실험에 사용하였다.

인위감염 실험에 사용한 모든 세균과 VHSV 균주는 국립수산과학원에서 제공받았고, 세균은 증균을 위해 Brain heart infusion (BHI, BD Biosciences) 액상배지를 이용하여 배양 조건에 따라 배양하였다.

② 건강한 강도다리 Total RNA 분리와 cDNA 합성

건강한 강도다리의 조직 내 PsNFIL3의 mRNA 발현수준을 확인하기 위해 5개체로부터 14가지의 주요 조직(뇌, 눈, 아가미, 두신, 체신, 심장, 간, 위, 비장, 근육, 피부, 장, 말초혈액 백혈구, 적혈구)을 무균적으로 적출하여 total RNA 추출 전까지 –80℃에서 보관하였다. 혈액은 heparin sodium (Sigma-Aldrich, USA)을 처리한 주사기를 이용하여 미부정맥으로부터 채혈하였고, 53% percoll 용액과 원심분리를 이용하여 PBLs와 RBC로 분리하였다.

적출 된 조직들과 분리된 혈구 샘플들은 total RNA 추출한 뒤 PrimeScript^TM 1st strand cDNA Synthesis Kit (Takara)를 이용해 제조사의 프로토콜에 따라 cDNA로 합성하였다. Total RNA의 분리는 적출한 조직에 RNAiso Plus 용액을 1 mL 첨가한 뒤 homogenizer를 이용해 완전히 마쇄시켰고, 100 µL의 chloroform (Daejung, South Korea)을 첨가한 후 vortexing하여 4℃에서 14,000 rpm으로 10분간 원심분리하였다. 상층액은 새로운 tube에 옮긴 후 200 µL의 PCI 용액(Phenol:chloroform:isoamyl alcohol, 25:24:1; Biosesang, South Korea)을 첨가하여 vortexing 후 같은 조건으로 원심분리 하였다. 상층액은 다시 새로운 tube에 옮겼고, genomic DNA를 제거하기 위해 5 U/µL의 Recombinant DNase Ⅰ (Takara) 3 µL과 10×DNase Ⅰ Buffer 20 µL를 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응액에 동량의 PCI용액을 첨가하여 4℃에서 14,000 rpm으로 10분간 원심분리 하였고, 상층액은 새로운 tube에 옮긴 후 isopropanol (Daejung) 500 µL과 3M sodium acetate (Takara) 50 µL, Dr.Gen (Takara) 5 µL을 첨가하여 위와 같은 조건으로 원심분리하였다. 원심분리 후 상층액은 제거하고 diethylpyrocarbonate (DEPC) water (Bioneer)로 희석시킨 75% ethanol을 600 µL 첨가하여 4℃에서 14,000 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 상층액을 완전히 제거하고 pellet을 건조 시킨 후 DEPC water를 20 µL 첨가하였다.

cDNA 합성은 total RNA 추출물 8 µL에 random primer 1 µL과 dNTP mixture 1 µL을 첨가하여 65℃에서 5분간 반응시킨 뒤 얼음 상에서 5분간 반응시켰다. 반응물에 5×Primer script buffer 4 µL과 RNase inhibitor 0.5 µL, Primer script RTase 1 µL, RNase free dH₂O 4.5 µL을 추가적으로 첨가하여 30℃에서 10분간 반응시켰고, 42℃에서 1시간 동안 반응시킨 뒤 마지막으로 95℃에서 5분간 반응시켰다.

③ Primer 제작

RT-qPCR에 사용된 primer는 PsNFIL3의 cDNA full-length sequence에 기초하여 Primer3 ver 0.4.0 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)을 이용하여 디자인하였다(<Table 1>).

<Table 1>

List of primer sets used for RT-qPCR

④ Quantitative real-time PCR (RT-qPCR)

건강한 강도다리에서 PsNFIL3의 발현수준을 알아보기 위해, TB Green Master Mix (Takara)를 이용하여 제조사의 메뉴얼에 따라 RT-qPCR을 수행하였다. 즉, cDNA template 1 μL와 forward·reverse primers 각각 1 μL, TB Green 12.5 μL, DDW 9.5 μL를 총 량 25 μL이 되도록 혼합하였다. 증폭조건은 50°C에서 4분간 그리고 95°C에서 10분간 initial denaturation, 후에 95°C에서 20초, 60°C에서 1분을 1회로 하여 총 45회 반응시켰으며 마지막으로 95°C 에서 15초, 60°C에서 30초, 95°C에서 15초 final dissociation 하였다. 최종적으로 확인된 PsNFIL3의 cycle threshold (Ct)값은 강도다리 elongation factor 1-alpha (EF-1α)의 Ct값과 비교하여 2^–ΔΔCT method (Livak and Schmittgen, 2001)에 의해 계산하였다. 모든 실험은 세 반복씩 수행하였고, 모든 데이터는 평균 ± 표준편차로 표현하였다. 조직들 간의 유의적 차이는 one-way analysis of variance (ANOVA) test에 의해 확인되었다(*p < 0.05, **p < 0.01).

나. 병원체 인위감염 후 시간별 발현분석

① 병원체 인위감염

병원체 인위감염 후 주요 조직 내에서 시간대별 mRNA의 발현수준을 확인하기 위해 VHSV와 S. parauberis PH0710 균주를 각각 PBS buffer에 1 × 10³ CFU/fish와 1 × 10⁶ copies/fish로 희석하여 건강한 강도다리에 피하주사 및 복강주사 하였고, 25 ± 1℃와 17 ± 1℃로 각각 사육 수온을 유지하였으며, 감염 실험 동안 사료 공급을 중단하였다. 인위감염 후 0, 1, 12시간과 1, 3, 5, 7일마다 5개체씩 무작위로 선발한 뒤 뇌와 아가미, 심장, 체신, 간, 장 비장을 적출하여 total RNA 추출 전까지 –80℃에서 보관하였다. Total RNA 추출에서 cDNA 합성까지의 모든 프로토콜은 Ⅱ-3-(2)와 동일하게 수행하였다.

② Quantitative real-time PCR (RT-qPCR)

다양한 병원체 인위감염에 의한 PsNFIL3의 발현분석을 위해, 위에 설명한 것과 같은 방법으로 RT-qPCR을 수행하였다. 그리고 각 유전자의 발현수준은 위의 기술사항과 동일하게 2^–ΔΔCT method에 의해 계산되었으며, 모든 데이터는 평균 ± 표준편차로 표현하였다. 통계처리는 one-way ANOVA test로 수행되었다(*p < 0.05, **p < 0.01).

Ⅲ. 연구 결과

1. PsNFIL3의 분자적 특성

강도다리의 주요 조직(백혈구, 적혈구, 간, 신장, 비장)의 NGS분석으로 확보한 PsNFIL3 cDNA의 분자적 특성을 확인하기 위해 특이적인 domain 등을 검색하였다. 또한 보고된 NFIL3의 서열들을 이용하여 multiple sequence alignment 분석과 계통발생학적 분석을 통해 PsNFIL3를 동정하였다.

가. PsNFIL3의 분자적 특성

PsNFIL3 유전자의 전체 서열은 총 1332 bp로 443개의 amino acid (aa)로 암호화되어 있었고, PsNFIL3 유전자는 특이적인 basic leucine zipper (bZIP) domain (57-122 aa)을 포함하고 있었다([Fig. 1]). PsNFIL3의 등전점(pI)은 4.98, 분자중량은 109.6 kDa으로 예측되었다. 이러한 서열정보는 NCBI의 database에 등록하여 OR699025 등록번호를 부여받았다.

[Fig. 1]

Platichthys stellatus NFIL3 nucleotide and amino acid sequences. bZIP domain are boxed.

나. Mutiple sequence alignment 분석

PsNFIL3 유전자와 다른 종에서 보고된 NFIL3 서열간의 비교분석을 위해 아미노산 서열을 이용해 multiple alignment를 수행한 결과 모든 종간 서열이 높은 수준으로 보존되어 있었다. PsNFIL3는 어류에서 Pleuronectes platessa의 NFIL3와 95.54%의 가장 높은 상동성을 보였으며, Lates calcarifer의 NFIL3와 80.65%으로 비교적 낮은 상동성을 보였다. 포유류에서는 Mus muculus의 NFIL3와 45.51%로 낮은 상동성을 확인할 수 있었다([Fig. 2]). 계통발생학적 분석결과 PsNFIL3는 Pleuronectes platessa NFIL3과 가장 가까운 근연 관계임을 확인할 수 있었다([Fig. 3]).

[Fig. 2]

Multiple alignments of PsNFIL3 with other species NFIL3 amino acid sequences. NCBI accession numbers of dicentracinare as follows: Platichthys stellatus WOS60109.1; Hippoglossus hippoglossus XP_034458719.1; Hippoglossus stenolepis XP_035040155.1; Lates calcarifer XP_018557465.1; Paralichthys olivaceus XP_019938052.1; Pleuronectes platessa XP_053266820.1; Seriola dumerili XP_022600333.1; Seriola lalandi dorsalis XP_023253646.1; Toxotes jaculatrix XP_040915196.1; Xenopus tropicalis NP_001015710.1; Gallus gallus NP_001383370.1; Mus musculus NP_059069.1; Homo sapiens ADK11690.1.

[Fig. 3]

Phylogenetic analysis of deduced PsNFIL3 amino acid sequences with NFIL3 other species. The phylogenetic tree was constructed using the neighbour-joining method within MEGA 4 software. Bootstrap sampling was performed with 1,000 replicates. The scale bar is equal to 0.2 change per amino acid position.

2. PsNFIL3의 mRNA 발현 특성

가. 정상어체에서의 조직별 발현분석

건강한 상태의 강도다리에서 PsNFIL3 mRNA의 발현은 장에서 가장 낮게 나타났으며, 발현 수준은 장의 값에 비해 배수 증가로 표현하였다. 아가미(약 260배)에서 가장 풍부하게 발현하였다. 피부와 체신에서도 각각 약 111배와 66배로 풍부하게 발현하였으며, 심장과 위에서는 25배, 23배 발현하였다([Fig. 4]).

[Fig. 4]

Expression analysis of PsNFIL3 genes in different tissues of healthy Platichthys stellatus by real-time PCR. EF-1α was used for normalizing the real-time PCR results. Data are presented as the mean ± SD from three independent cDNA samples with three replicates from each sample. Asterisks indicate significant differences (*p < 0.05, **p < 0.01) versus the intestine.

나. 병원체 인위감염 후 시간별 발현분석

VHSV를 인위감염 시킨 후 12시간째에 강도다리의 체신, 비장, 아가미, 간, 뇌, 장, 심장에서 PsNFIL3 mRNA의 발현수준은 유의적으로 up-regulation 되었다. 장에서는 감염 후 12시간째에 up-regulation 되다가 다시 down-regulation 되었다([Fig. 5]).

[Fig. 5]

Gene expression of PsNFIL3 in the trunk kidey, spleen, gill, liver, brain, intestine and heart after infection with VHSV (A), Streptococcus parauberis PH0710 (B). Levels of PsNFIL3 transciptswere quantified relative to that of EF-1α levels. Data are presented as the mean ± SD from three independent cDNA samples with three replicates for each sample. Asterisks represent significant differences compared to the control (PBS) group by ANOVA (*p< 0.05, **p< 0.01).

S. parauberis PH0710를 인위감염 시킨 후 PsNFIL3 mRNA의 발현수준은 간에서 1일째에 up-regulation 되었으며, 장과 뇌에서는 7일째에 유의적으로 up-regulation 되는 것을 확인하였다([Fig. 5]).

Ⅳ. 결 론

NFIL3는 세포 생존과 세포 사멸, 항염증 반응, 생물학적 주기의 변동 메커니즘을 포함한 과정의 필수적인 조절 분자이다(Cowell., 2002). 이전 연구에서 NFIL3는 포유류의 pro-B 림프구에서 anti-apoptotic effector로서 기능하며, NFIL3의 발현은 pro-B 세포의 생존에 긍정적인 영향이 있음을 확인할 수 있었다(Ikushima et al., 1997).

이번 연구에서는 비특이적 면역 유전자인 NFIL3를 NGS분석을 이용해 강도다리로부터 분리 및 동정하여 분자생물학적 특성과 발현 분석적 특징에 대해 확인하였다. NFIL3는 포유류의 bassic leuicne zipper (bZIP) 전사 인자 superfamily에 속하는 인자이다. 전사 인자 superfamily에는 cAMP response element binding protein (CREB), activating transcription factor, activator protein 1, CCAAT enhancer binding protein (C/EBP), nuclear factor (erythroid-derived 2), proline and acidic residue rich (PAR) 계열이 포함되어있다. bZIP 인자는 양친매성 α-helical dimerization 도메인을 포함하며, leucine 잔기의 헵타드 반복으로 구성된 leucine zipper 영역을 특징으로 한다(Hurst, 1994; Cowell, 2002; Vinson et al., 2002; Acharya et al., 2006; Li et al., 2011). 이전 연구에서 포유류 NFIL3의 서열은 bZIP 도메인의 N-말단 부분(amino acids 79-95)에는 DNA에 직접 결합하는 basic motif가 포함되어 있고, C-말단 부분(amino acids 99-106)에는 amphipathic leucine zipper 영역을 포함한다고 보고되어 있다(Keniry et al., 2014). bZIP는 특정 DNA 서열에 결합하여 유전자 전사를 조절하는 homodimers와 heterodimers를 형성하며, 신체 전반의 다양한 과정에 영향을 미치는 것으로 알려져 있어, 기능적으로 중요한 역할을 수행할 것으로 생각된다(Acharya et al., 2006). 또한 계통발생학적 분석 결과 PsNFIL3는 다른 어류의 NFIL3와 한 cluster를 이루며 높은 유연관계를 확인할 수 있었다. 이는 PsNFIL3가 어류의 진화과정에서 잘 보존되어 온 것으로 생각된다.

이전 연구에 따르면 인간의 NFIL3는 신장에서 높은 mRNA 발현이 확인되었다(Fagerberg et al., 2014). 이번 연구의 조직별 발현분석에서는 강도다리의 여러 조직에서 PsNFIL3의 mRNA 발현이 나타나는 것을 확인하였으며, 이 중 특히 아가미에서 풍부하게 발현하였으며, 피부와 체신에서도 풍부한 발현을 확인할 수 있었다([Fig 4.]). 어류의 아가미와 피부는 처음 병원체가 침입하는 경로로 병원체의 접촉에서 가장 민감하고 박테리아에 직접적으로 노출되는 숙주 방어 메커니즘의 중요한 부위로 알려져있다. 아가미와 피부를 통해 병원체가 숙주 내에 들어가면 대식 세포에 의해 처리되어 혈액으로 전신 운반된다고 보고되어져 왔다(Li et al., 2012; Li et al., 2018). 체신에서의 풍부한 발현 결과는 어류의 면역체계 중 조혈기관인 신장에서 높은 발현이 나타나는 것으로 보아 PsNFIL3가 면역 반응에 있어서 중요한 역할을 할 것으로 생각된다(Lieschke et al., 2009).

강도다리 양식 산업에서 중요한 병원체인 세균과 바이러스 감염에 따른 강도다리의 PsNFIL3의 체신, 비장, 아가미, 간, 뇌, 장, 심장에서의 조직별 발현분석 결과 VHSV 감염 후 12시간째에 체신, 비장, 아가미, 심장에서 up-regulation 되었고, 장에서는 감염 후 12시간째에 up-regulation 되다가 다시 down-regulation 되었다. S. parauberis PH0710의 인위감염 후에는 간에서 1시간째에 up-regulation 되었고, 장과 뇌에서는 7일째에 유의적으로 up-regulation 되었다.

VHSV는 국내 양식 어류인 P. stellatus와 Paralichthys olivaceus에 높은 폐사를 일으키는 바이러스로 알려져있다(Kim et al., 2009). 이전 연구에 따르면 VHSV 바이러스가 가장 풍부한 부위는 신장, 심장, 비장으로 알려져 있다(Smail, 1999). 이번 연구에서 VHSV 감염 후 12시간째에 체신, 비장, 아가미, 심장에서 PsNFIL3의 up-regulation이 나타났다. 인위감염 후 12시간 째에 조직별 PsNFIL3의 발현량이 급격히 높아진 것은 PsNFIL3가 어류 체내에서 VHSV의 확산을 억제하기 위해 잠재적으로 관여한 것으로 보여지며, 이는 PsNFIL3가 바이러스 감염의 진행을 완화하는데 중요한 역할을 하는 것을 나타낸다. 본 연구에서 VHSV 인위감염 후 체신, 심장, 아가미에서의 up-regulation이 PsNFIL3와 관련이 있는 것으로 추측했다. 이는 건강한 P. stellatus의 PsNFIL3 조직별 발현분석에서 아가미, 심장, 체신이 높은 수준으로 발현된 것과 연관될 수 있으며, 아가미의 경우 이전 연구에 따르면 P. olivaceus에서 VHSV 감염 후 아가미가 초기 VHSV 흡수에 중요한 역할을 하며, VHSV가 주로 12시간 이후에 아가미 lamella의 상피와 혈관에서 복제되는 결과와 유사하다(Qadiri et al., 2020). VHSV 인위감염 후 비장에서의 PsNFIL3 up-regulation은 VHSV 표적 장기에 대한 이전 연구에 따라 VHSV 감염 후 비장에서 면역 반응을 보인 것으로 생각된다(Smail, 1999).

또한 VHSV 감염 후 장에서 PsNFIL3가 12시간째에 up-regulation 되었다가 다시 down-regulation된 것은 이전의 NFIL3 결핍 mouse에서 NFIL3가 장 면역 보호에 필수적인 innate lymphoid cell (ILC) 발달에 핵심적인 조절자 역할을 하고, 적응 면역 세포의 발달과 기능의 여러 측면을 조절하며, 광범위한 발현과 연관되어 선천성 면역 체계의 발달에도 영향을 미칠 가능성이 높다는 연구 결과에 따라 이번 연구에서도 PsNFIL3가 VHSV 감염 후 장에서 면역 보호의 핵심 조절자로 역할하고 선천 면역 반응을 보인 것으로 생각된다(Ikushima et al., 1997; Kashiwada et al., 2010; Kobayashi et al., 2011; Motomura et al., 2011; Seillet et al., 2013; Seillet et al., 2014).

S. parauberis PH0710 인위감염 시킨 후 PsNFIL3의 발현 수준은 간에서 1일째에 up-regulation되었고, 장과 뇌에서는 7일째에 유의적으로 up-regulation 되는 것을 확인하였다. 간에서의 PsNFIL3의 높은 발현은 건강한 S. paramosain와 C. idella의 NFIL3 조직별 발현분석에서 간췌장과 간 조직이 다른 조직의 발현과 비교하여 유의미한 발현을 보인 이전 연구의 결과와 유사하다(Gu et al., 2019; Yu et al., 2014a). 갑각류의 간췌장은 섭취 물질의 흡수와 저장을 담당하는 주요 기관이자 중요한 면역 기관으로 작용한다는 이전 연구 결과와 본 연구 결과를 토대로 간에서 PsNFIL3가 높은 발현을 보인 것은 병원성 미생물의 자극에 대항하는 중요한 기능을 가진 것이라고 보여진다(Xu et al., 2014). 장과 뇌에서 7일째에 PsNFIL3의 높은 발현을 보인 것은 인위감염 후 시간의 흐름에 따라 장과 뇌와 같은 말초조직에서 면역 반응을 보인 것이라고 생각되며, 장에서의 7일째의 PsNFIL3의 up-regulation은 VHSV 인위감염 실험 결과와 마찬가지로 PsNFIL3가 장 면역 보호에 조절자로서 역할한 것으로 보인다. 추가적으로 뇌에서의 PsNFIL3의 up-regulation은 Schizopygopsis pylzovi, Oreochromis niloticus에서 Streptococcus를 인위감염 시킨 후 뇌수막의 울혈과 뉴런의 괴사, 부종, 액포의 변성과 염증 세포의 침윤을 확인할 수 있었다(Deng et al., 2017; Yang et al., 2018). NFIL3가 상향조절되어 신경의 보호를 보이는 구체적인 기전은 아직 밝혀지지 않았지만, NFIL3는 세포 내 Ca²⁺ 농도의 상승과 cAMP 반응 요소 결합 단백질의 활성화에 의해 Trans-activating된다(Nishimura Y and Tanaka T, 2001; MacGillavry et al., 2009). 다양한 신경 관련 질환에서 Ca²⁺ 항상성의 파괴는 발병 과정에서 일어나며, Aβ, 산화 스트레스, 외인성 독소 등 다양한 신경 손상 자극이 신경 세포의 세포 내 Ca²⁺ 농도 증가를 유도한다. 고농도의 글루타메이트, 과산화수소, 칼슘 이온 운반체에 노출된 뉴런에서 NFIL3가 상향 조절될 것을 고려할 때, Ca²⁺의 과도한 유입이 뉴런에서 NFIL3의 상향 조절을 유발한다고 보고되었다(Bossy-Wetzel et al., 2004; Tamai et al., 2014). 이전의 연구 결과를 바탕으로 이번 연구에서 S. parauberis PH0710 감염 후 7일째에 뇌에서 PsNFIL3이 up-regulation된 것은 S. parauberis PH0710 인위감염 후 뇌 신경 세포의 손상으로 인해 뉴런에서 PsNFIL3의 상향 조절이 유발된 것으로 보이지만, Streptococcus 감염에 따른 뇌에서의 PsNFIL3 조절에 관련된 추가적인 연구가 필요하다고 생각된다.

본 연구에서는 강도다리로부터 PsNFIL3를 분리 및 동정하였고, 분자적 특성과 발현분석을 수행하였다. 또한 정상어체의 조직과 세균·바이러스성 질병에 인위감염된 강도다리의 조직에서 PsNFIL3 발현 조절을 확인하였으며, 이를 통해 PsNFIL3가 어류의 병원체 감염에 대해 면역단백질로써 기능을 수행할 수 있음을 시사한다. 이후 PsNFIL3 면역반응의 정확한 기능 분석이 필요할 것으로 생각된다.

Acknowledgments

이 논문은 2023년도 국립수산과학원 연어류 예방양식연구사업(R2023061)의 지원으로 연구되었음.

References

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