양식 범가자미(Verasper variegatus) 질병 모니터링 및 Edwadsiella piscicida 병원성 평가

Ⅰ. 서 론

범가자미(Verasper variegatus)는 가자미목, 가자미과에 속하는 어종으로, 우리나라 서남부 연근해, 일본 중부 이남, 동중국해에 분포하며 육질이 우수하고 식감과 맛이 뛰어나 최고급 횟감으로 가격 면에서도 부가가치가 높은 어종으로 평가받고 있다. 자연수계에서 어획되는 개체수가 적어 수요량에 비하여 공급량이 부족함에 따라 국내에서는 범가자미 양식을 위해, 1996년~2000년에 범가자미 산란기 호르몬 변화 및 호르몬 처리에 따른 성성숙에 관한 연구가 수행되었지만(Kim et al., 1998), 현재까지 국내 범가자미 양식에 대한 연구는 여전히 부족하다. 일본에서는 범가자미 종자 생산에 관한 연구와 다양한 수온에서 빛에 따른 범가자미 성장 및 내분비계 영향에 대한 연구가 수행되었지만(Shimizu et al., 2019), 여전히 타 어종에 비해 양식 연구가 매우 부족한 실정이다.

최근 경북 및 제주 등지의 넙치, 강도다리 양식장에서는 종묘생산된 범가자미를 일부 수조에 입식하여 양식하고 있다. 범가자미와 같은 새로운 품종의 성공적인 양식을 위해서는 건강한 종묘 생산, 먹이생물, 생리 등 양식기술 확립과 질병 관리가 매우 중요하다. 넙치와 강도다리 양식장에 범가자미를 입식하여 양식하게 된다면, 넙치와 강도다리에서 주로 발생하는 질병이 범가자미에 전파되어 새로운 숙주가 될 가능성이 있다. 그러나 범가자미 양식 현장에서의 질병 발생 정보 및 병원체 감염 특성에 대한 연구는 전무하다. 특히, 기후 변화와 병원체 변이 등으로 병원체의 숙주 범위가 확대되어 심각한 경제적 손실을 유발할 수 있기 때문에 질병관리를 통한 적절한 사육관리 및 예방방법에 대한 대책 마련이 필요하다. 따라서 질병 모니터링을 통한 질병 발생 동향과 역학 정보 수집은 질병을 사전에 예방하고 피해를 최소화하기 위한 대책 수립에 중요한 자료로 활용될 수 있다(Hwang et al., 2019; Woo et al., 2022).

넙치의 주요 세균성 질병인 에드워드병의 원인균인 Edwardsiella piscicida는 25℃를 넘는 고수온기에 지느러미 및 복부 발적과 충혈, 복부팽만, 탈장 등의 증상을 동반하여 심각한 폐사를 유발한다(Leung et al., 2019). 따라서 양식 넙치에서 발생하고 있는 E. piscicida가 범가자미에서도 발생할 개연성이 있어 범가자미에 대한 E. piscicida의 위험성을 조사하여, 병원체의 감염 가능성을 파악하고, 효과적인 예방 및 관리 대책을 마련해야 한다.

본 연구에서는 2022년 경북에 소재한 범가자미 양식장을 대상으로 기생충성 질병, 세균성 질병, 바이러스성 질병에 대한 모니터링을 수행하였다. 또한, 넙치에서 심각한 폐사를 유발하는 E. piscicida를 범가자미에 인위감염하여 병원성을 확인하였다.

Ⅱ. 연구 방법

1. 기생충성 및 바이러스성 질병 검사

경상북도 소재 범가자미 양식장에서 2022년 6월, 7월, 8월, 11월에 각 4마리씩 총 16마리의 범가자미를 채집하였다. 범가자미는 고가의 어종이므로 시료량을 최소화하였다. 범가자미에서 기생충성 질병을 검사하기 위해, 외부 및 내부 임상증상을 확인하고 아가미, 체표, 임상증상 부위를 채취하여 현미경(Axioscope 7 MAT)을 통해 관찰이 가능한 스쿠티카, 백점충, 트리코디나 등을 검경하였다.

분석시료의 바이러스성 질병을 검사하기 위해 비장과 신장(50mg)을 무균적으로 채취하였다. 조직에서 DNA와 RNA를 추출하기 위해 Patho Gene-spin^TM DNA/RNA Extraction Kit (iNtRON Biotechnology, Korea)를 이용하였으며, cDNA 합성은 TOPscript^TM cDNA Synthesis Kit (Enzynomics)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 합성하였다. 추출한 핵산과 cDNA는 분석 전까지 –80℃에 보관하였다. PCR은 red seabream iridovirus (RSIV), lymphocystis disease virus (LCDV), viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV), marine birnavirus (MBV), hirame rhabdovirus (HRV) 총 5종의 바이러스성 질병에 대해 실시하였다. PCR primer와 조건은 <Table 1>과 같다. PCR 증폭 산물은 1.5% agarose gel에서 전기영동하여 Gel-doc에서 결과를 관찰하였다.

<Table 1>

Primers and PCR conditions used in this study

Ⅲ. 연구 결과

1. 기생충성 및 바이러스성 질병 모니터링

경상북도 소재 양식장에서 범가자미 16마리(334.3±127.1 g, 32.5±2.5 cm)를 대상으로 기생충성 질병 모니터링 결과, 아가미, 체표 점액 및 임상증상 부위에 모두 기생충이 관찰되지 않았다(<Table 2>). 넙치에 감수성이 있는 RSIV, LCDV, VHSV, MBV 및 HRV에 대하여 바이러스 검출 유무를 분석한 결과 모든 범가자미 시료에서 검출되지 않았다(<Table 2>).

<Table 2>

The results of disease monitoring on spotted halibut in 2022

2. 세균성 질병 모니터링

가. Vibrio의 계통발생학적 분석

신장, 비장 및 체표 궤양 부위에서 분리한 세균의 DNA를 사용하여 16S rRNA 염기서열의 계통발생학적 분석 결과, 비브리오 속(Vibrio rotiferianus 등) 6개 strain이 동정되었다. 범가자미의 신장(6월)과 비장(8월)에서 분리한 균주는 V. renipiscarius로 동정되었다. 6월 신장에서 분리된 균주는 Aliivibrio finisterrensis, 7월 범가자미의 체표 궤양에서 분리된 균주는 V. rotiferianus로 동정되었다. 8월 아가미뚜껑 궤양 부위에서 분리된 균주는 V. gigantis, 체표 궤양에서 분리된 균주는 V. pomeroyi로 동정되었다(<Table.2>). Uridlylate kinase 효소를 암호화하는 pyrH 유전자를 이용하여 각 Vibrio 균주를 분석한 결과와 16S rRNA를 이용한 계통발생학적 분석 결과가 모두 동일하였다([Fig. 1]).

[Fig. 1]

Phylogenetic tree based on the partial nucleotide sequence of 16S rRNA (A) and pyrH (B) retrieved from GeneBank. The distinct Vibrio species were determined by the Neighbour-joining method using Mega (ver 11.0.10) software. The numbers indicate the percentages bootstrap support from 1000 replicates.

나. Aeromonas의 계통발생학적 분석

11월에 수행된 모니터링 중 아가미뚜껑 궤양 부위에서 분리된 균주 A. salmonicida에 대하여 gyrB 유전자를 이용한 계통발생학적 분석을 실시하였다. 그 결과, A. salmonicida subsp. masoucida, A. salmonicida subsp. achromogenes, A. salmonicida subsp. salmonicida와 함께 동일한 cluster를 형성함을 확인하였으나, 이들 아종 사이의 구분은 명확하지 않았다([Fig. 2]). vap 유전자를 이용하여 계통발생학적 분석을 진행한 결과, 아종 간 구별이 가능하였으며, 분리된 Aeromonas 균주는 A. salmonicida subsp. masoucida와 동일한 cluster를 형성하여, 최종적으로 A. salmonicida subsp. masoucida로 동정되었다([Fig. 2]).

[Fig. 2]

Phylogenetic tree based on the partial nucleotide sequence of gyrB (A) and vap (B) retrieved from GeneBank. The distinct Aeromonas species were determined by the Neighbour-joining method using Mega (ver 11.0.10) software. The numbers indicate the percentages bootstrap support from 1000 replicates.

3. E. piscicida 인위 감염 및 폐사율 조사

E. piscicida를 접종한 실험구에서는 농도 의존적인 폐사율이 관찰되었다([Fig. 3]). 1×10⁷ CFU/mL 감염 시, 3일째부터 폐사가 시작되어 감염 8일째 누적 폐사율이 100%에 도달하였다. 1×10⁶ CFU/mL 감염은 10⁷보다 폐사 시작이 늦어졌지만 5일째부터 폐사가 시작되어 10⁷과 동일하게 100% 폐사하였다. 1×10⁵, 1×10⁴, 1×10³ CFU/mL에서는 각 80%, 50%, 40%의 누적 폐사율이 확인되었으며, PBS를 접종한 대조구는 실험기간 동안 폐사가 발생하지 않았다. 감염된 개체는 넙치 E. piscicida 임상증상과 유사하게 복부팽만, 탈장, 신장, 비장 비대 등의 증상이 확인되었으며, 높은 폐사율이 동반되어 범가자미는 E. piscicida에 감수성이 있었다.

[Fig. 3]

Cumulative mortality of the spotted halibut by E. piscicida infection

Ⅳ. 결 론

본 연구에서는 양식 신품종인 범가자미에 대한 질병 모니터링과 E. piscicida 감수성 조사를 실시하였다. 기생충과 바이러스는 검출되지 않았으나, 6종의 Vibrio sp. (V. renipiscarius, V. rotiferianus, V. gigantis, V. pomeroyi, Aliivibrio finisterrensis)와 1종의 A. salmonicida subsp. masoucida가 분리되었다.

V. renipiscarius는 스페인 지중해 연안 양식장의 건강한 gilthead seabream (Sparus aurata)에서 분리되었지만(Tarazona et al., 2015), 어류에 대한 병원성은 아직까지 알려지지 않았으며 Shon et al.(2019)은 비병원성으로 분류하였다. V. rotiferianus는 로티퍼 배양 시스템의 사육수와 로티퍼에서 처음 분리되었으며(Gomez-Gil et al., 2003), 유럽농어(Dicentrarchus labrax) (Uzun and Ogut, 2015), 자주복(Takifugu rubripes) (Wu et al., 2015) 및 박대(Cynoglossus semilaevis) (Chen et al., 2012)에 병원성을 가지는 것으로 보고되어 있다. 최근에는 조피볼락의 체표 궤양을 형성하는 병원체로 확인되었으며(Zhang et al., 2019), 범가자미의 체표 궤양 부위에서 분리된 V. rotiferianus도 동일한 임상증상을 동반하여 범가자미에서도 병원성이 있을 것으로 사료된다.

V. gigantis, V. pomeroyi, Aliivibrio finisterrensis가 참굴(Crassostrea gigas), 가리비(Nodipecten nodosus), 바지락(Venerupis philippinarum)에서 각각 최초 분리되었다(Roux et al., 2005; Thompson et al., 2003; Beaz-Hidalgo et al., 2010). 최근 들어 패류에서 주로 분리되는 균(V. gigantis, V. pomeroyi, Aliivibrio finisterrensis 등)이 제주도에서 양식된 넙치에서도 상당수 분리되는 사례가 보고된 바 있다(Sohn et al., 2019). V. gigantis는 유럽농어에서, V. pomeroyi는 무지개송어에서 병원성이 확인되었고(Austin et al., 2005; Yilmaz et al., 2023), 범가자미 아가미뚜껑 또는 체표의 궤양 부위에서 V. gigantis, V. pomeroyi이 분리되어 질병 발생과의 연관성이 있을 것으로 판단된다. 본 연구에서 분리된 V. rotiferianus 외 Vibrio 종의 어류 병원성 연구는 아직 부족한 실정이므로 해당 균주들의 병원성을 규명하는 후속 연구가 필요할 것으로 사료된다.

Aeromonas 속은 높은 유전적 유사성으로 인해 16S rRNA 분석만으로 종을 정확히 분류하는 데 어려움이 많다(Lim et al., 2017). 이를 해결하기 위해 gyrB, vap 유전자를 이용하여 동정하고 있지만(Lim et al., 2017), vap 유전자를 이용한 계통발생학적 분석이 아종 간 구별이 가능하여 범가자미에서 분리된 Aeromonas는 A. slamonicda subsp. masoucida로 동정되었다([Fig. 2]). A. salmonicida는 절창병의 주요 원인균으로 송어 및 연어과 어류에 높은 폐사율을 나타낸다(Lim et al., 2017). 과거에 비정형 A. salmonicida는 주로 소하성 어류에 감염되는 것으로 알려져 있었으나, 최근 50 여종이 넘는 해양 및 담수 어종에서 분리되고 있다(Wiklund and Dalsgaard, 1998). 비정형 A. salmonicida에 감염된 어류는 체표에 궤양을 형성하는 반면, 넙치의 경우에는 간 출혈, 신장 비대 및 뇌 부위에 출혈이 나타나는 것으로 보고되었다(Kim et al., 2022). 강도다리 및 조피볼락에서 A. salmonicida subsp. masoucida의 병원성이 보고되었으며(Kim et al., 2022; Han et al., 2011), 이는 A. slamonicda subsp. masoucida가 다양한 해산 어류에 질병을 유발할 수 있음을 시사하고 아가미뚜껑 궤양 부위에서 분리됨에 따라 범가자미에서 질병 유발 가능성을 제시한다. 향후 범가자미에서 분리된 A. slamonicda subsp. masoucida 균주와 다양한 Vibrio 속 균주의 병원성 연구가 필요하다고 사료된다. 이를 통해 범가자미 양식 시 발생할 수 있는 질병 예방 및 관리에 기여할 수 있을 것으로 사료된다.

범가자미에서 E. piscicida의 감수성 조사 결과, 범가자미에서 높은 병원성이 확인되었다([Fig. 3]). 넙치 또는 강도다리 양식장에서 범가자미를 같이 양식하기 때문에 E. piscicida와 같은 넙치의 질병이 범가자미에게로 전파 또는 발생 가능성이 존재한다. 또한, 범가자미의 질병이 넙치, 강도다리에 전파될 가능성이 있다. 따라서 이러한 상호 감염 가능성을 고려한 종합적인 질병 관리와 예방 전략이 필요하다. 앞으로도 새로운 양식품종인 범가자미의 양식 전주기 질병 모니터링을 통해 질병 발생 동향 및 감수성 질병 정보를 파악하여, 양식 환경의 개선과 더불어 체계적인 질병 관리가 필요하다. 따라서 본 연구는 범가자미 질병 모니터링과 E. piscicida 감수성 조사를 통해 범가자미 질병 관리에 중요한 정보를 제공한다.

Acknowledgments

이 논문은 2022학년도 한국해양대학교 신진교수 정착연구지원사업 연구비의 지원을 받아 수행되었습니다.

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