남해안 어류 양식장 및 인근 육상오염원에서 분리한 분변 지표 세균의 항생제 내성 특성

Ⅰ. 서 론

우리나라의 수산업 중에서 양식 어업으로 생산된 수산물은 전체 수산물 공급량 중 차지하는 비중이 점차 증가하는 추세에 있다. 해상 양식장은 전 세계적으로 중요한 식량 공급원으로 자리잡고 있으며, 그 경제적 가치는 지속적으로 증가하고 있다. 하지만 이러한 양식장의 대부분은 육지와 인접한 연안에서 주로 양식되고 있고 이러한 지역은 육지의 하천, 생활하수, 가축 사육 농가의 폐수 등에서 배출되는 오염물질에 의해서 수산물이 쉽게 오염될 수 있다. 이러한 육상 오염원은 사람과 가축 유래의 분변에서 유래되어 전염병이나 식중독 등의 감염증을 유발하는 인체 병원성 세균이 함유되어 있을 우려가 있으며(Hah et al., 2011; Kang et al., 2017), 분변 등의 오염원이 하천이나 하수관로를 통하여 해상으로 유입됨으로써 하천 및 연안 해역 등의 환경오염에 영향을 주기도 한다(Lipp et al., 2001; Murray et al., 2001; Oh et al., 2012).

특히 가축 사육 농가에서 배출되는 분변은 노천에 야적되어 있거나, 가축 사육 농가가 허가·신고한 개별 처리시설을 개보수하지 않고 방치한 경우가 많아 부적정 처리하거나 무단 방류하는 경우도 있으며 정화 처리 비율도 낮아 인근 수질 환경에 악영향을 줄 가능성이 높다(Jung et al., 2012).

또한 가축의 전염병 예방 및 성장 촉진의 목적으로 사용되는 항생제도 문제가 될 수 있다. 항생제의 사용으로 인한 내성 세균의 발생과 확산은 공중 보건의 심각한 위협으로 제기되고 있으며(Van et al., 2015; Chantziaras et al., 2014), 식약처와 농림축산식품부에서 발표한 「2022년 국가 항생제 사용 및 내성 모니터링(동물, 축산물)」에 따르면 축산업계로 판매된 항생제의 총 양이 2013년에는 820톤이었으나 점차 증가하여 2022년에는 960톤에 이르렀다고 발표했다. 항생제 사용량이 점차 증가함에 따라 다제내성균을 포함한 항생제 내성균의 출현 빈도가 높아지기 시작했으며, 가축 분변 유래 항생제 내성균이 환경으로 유입되어 항생제 내성 전파가 가속화되고 있다(He et al., 2016).

한편, 육지와 인접한 패류 양식장에서 강우 발생 시 해역 주변의 하천 및 배수유역을 통해 오염물질이 패류 중 분변계대장균 (fecal coliform), 대장균의 오염도를 증가시킨다는 연구(Park et al., 2012; Kim et al., 2023; Lee et al., 2023), 수산물 양식장에서 분리한 세균의 항생제 내성 분포와 다제내성균 분포에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있으나(Jo et al., 2016; Jeong et al., 2022; Park et al., 2022; Shin et al., 2023), 연안에 위치한 수산물 양식장 오염의 근원이 될 수 있는 가축 분변과 같은 오염원의 분변 비표 세균 오염도와 오염원과 양식 수산물에 대한 항생제 내성 패턴을 비교·분석한 연구는 미비한 실정이다.

따라서 본 연구에서는 어류 양식장의 양식 해수 및 어류와 양식장 인근으로 배출되는 하천수, 해당 하천으로 유입될 가능성이 있은 가축 사육 농장의 분변에서 대장균 (Escherichia coli) 및 장구균 (Enterococcus faecalis/facium)의 오염도를 조사하고 검출된 세균으로부터 항생제 내성 특성을 파악함으로써 육상 오염원이 해역으로 유입되어 해상 양식장에 직·간접적으로 영향을 미칠 가능성을 파악하고자 하였다.

Ⅱ. 연구 방법

1. 조사 지점 및 시료 채취

어류 양식장, 하천수 및 가축 분변 사이의 분변 지표 세균의 오염도를 확인하고 분리된 세균의 항생제 내성 조사 및 패턴을 비교하기 위해서 경상남도 거제시 둔덕면 배수유역 인근에 위치한 해상 가두리식 양식장의 양식 해수와 양식장에서 사육하고 있는 조피볼락 (Sebastes schlegelii)과 참돔 (Pagrus major)을 채취하였고 해당 양식장과 인접하여 영향을 줄 수 있는 하류 유역의 하천수를 채취하였으며 가축 사육 농장의 분변 등이 유입될 수 있는 하천 상류 유역의 하천수를 채취하였다. 해당 하천과 인접한 가축 사육 농장에서는 각각 닭 (Gallus gallus domesticus)과 소 (Bos taurus)의 분변 시료를 채취하였으며 채취 지점은 [Fig. 1]에 나타내었다.

[Fig. 1]

Sampling locations of Fish farm (◇; Seawater, ◆; Fish), Stream water (□; Upstream, ■; Downstream) and Livestock manure (○; Chicken farm, ●; Cattle farm) in Dunduk-myeon, Geoje, Gyeongsangnam-do, Korea.

모든 시료의 채취는 2023년 7월부터 11월까지 총 5회씩 총 35개의 시료를 채취하여 실험을 진행하였다. 어류 시료는 조피볼락과 참돔을 각각 5마리씩 채취하였으며 가축 분변 시료는 멸균된 스푼으로 닭과 소의 분변을 각각 200g 이상 채취하였다. 채취한 어류와 가축 분변 시료는 멸균된 비닐백(whirl-pak bags; Nasco International Inc., Janesville, WI, USA)에 담아 보관하였다.

양식 해수 및 하천수는 멸균된 비커를 이용하여 무균 채수병에 1L 이상 채취하였다. 모든 시료는 10 ℃이하로 유지되는 아이스 박스에 담아 실험실로 운반하여 12시간 이내에 실험을 실시하였다.

2. 대장균과 장구균 분리 및 동정

E. coli와 Enterococcus spp.의 분리를 위해 어류 양식장에서 채취한 조피볼락과 참돔은 표면을 세척한 뒤 각각 5마리 시료의 아가미와 내장만을 취하여 균질화한 이후에 시험에 사용하였고, 양식 해수, 하천수 및 가축 분변 시료는 별도의 전처리 없이 시험에 사용하였다.

E. coli의 분리를 위하여 EC medium broth (Difco, Detroit, MI, USA) 225 mL에 시료 25 g을 접종하여 44±0.5 ℃에서 24±2시간동안 증균배양한 후, Tryptone bile X-glucuronide agar (Merck, Darmstadt, Germany)에 획선 도말하여 44±0.5 ℃에서 24±2시간 배양한 후, 청색 또는 청녹색의 전형적인 E. coli 집락을 선택하여 2% NaCl이 첨가된 Tryptone soya agar (Oxoid, Basingstoke, UK)에 분리배양하였다(<Table 1>).

<Table 1>

Medium and culture condition for microbiological analysis

Enterococcus spp.의 분리를 위하여 6.5% NaCl이 첨가된 Azide dextrose broth (Merck, Darmstadt, Germany) 225 mL에 시료 25 g을 접종하여 37±0.5 ℃에서 48±2시간동안 증균배양한 후, Enterococcosel agar (BD Difco, Sparks, NV, USA)에 획선 도말하여 37±0.5 ℃에서 48±2시간 배양한 후 검은색의 전형적인 Enterococcus spp. 집락을 선택하여 2% NaCl이 첨가된 TSA에 분리배양하였다(<Table 1>).

순수 분리된 단일 colony는 0.85% NaCl 용액 3 mL에 0.5 McFarland로 희석하여 VITEK2 system (BioMerieux, Marcy, France)으로 동정하고 항생제 내성 시험의 균주로 사용하였다.

3. MIC Panel을 이용한 항생제 내성 시험

어류 양식장, 하천수 및 가축 분변에서 분리된 분변 지표 세균의 항생제 내성 시험은 국가 항생제 사용 및 내성 모니터링(MFDS, 2020)의 방법에 따라 최소억제농도법(minimum inhibitory concentrations, MICs)으로 실험하였다.

E. coli 균주는 16종의 항생제가 농도별로 coating되어 있는 KRNV5F panel (Sensititre, East Grinstead, UK)을 사용하였고 Enterococcus spp. 균주는 KRNVP2F panel (Sensititre, East Grinstead, UK)을 사용하였다. 사용된 항생제의 종류, 시험 농도 및 breakpoints를 <Table 2>에 나타내었다.

<Table 2>

Types of antimicrobials and breakpoints used in MIC test

MIC를 이용한 항생제 내성 시험을 위해 어류 양식장, 하천수 및 가축 분변에서 분리된 세균을 Muller hinton agar (Oxoid, Basingstoke, UK)에 획선 도말하여 37±1 ℃에서 18-20시간동안 배양하였다. 그 후 평판배지에서 3~5개 집락을 취하여 5 mL의 멸균된 증류수에 0.5 McFarland 농도가 되도록 희석한 뒤, 탁도를 조정한 희석액 10 μL를 Cation Adjusted Muller Hinton Broth (Sensititre, Lenexa, KS, USA) 11 mL에 접종하여 vortexing 하였다. 세균 희석액이 첨가된 Cation Adjusted Muller Hinton Broth 을 각각의 분리된 세균에 해당하는 panel의 well마다 50 μL씩 접종액을 분주하여 37±1 ℃에서 18–24시간동안 배양한 후 OptiRead (Seneititre, East Grinstead, UK) 장비를 사용하여 균 증식이 완전히 억제되는 가장 낮은 농도를 최소억제농도로 판정하였다. 판정된 최소억제농도는 항생제별 breakpoint와 비교하여 항생제 내성 및 감수성을 판정하였다.

분리균주의 항생제 다제내성 정도를 확인하기 위해 MAR (multiple antimicrobial resistance) index를 사용하였으며, MAR index는 항생제 내성 시험에 사용된 총 항생제 종류의 수에 대한 내성을 나타내는 항생제 종류의 수의 비율(내성을 나타내는 항생제 종류의 수/시험에 사용된 총 항생제 종류의 수)로 계산하였다(Krumperman, 1983; Titilawo et al., 2015).

Ⅲ. 연구 결과

1. 남해안 어류 양식장 및 육상오염원 중 분변 지표 세균 검출 및 분리 현황

2023년 7월부터 2023년 11월까지 경남 거제시 둔덕면 유역 양식장에서 채취한 어류(조피볼락 및 참돔), 양식 해수, 인근 배수유역의 하천수 및 가축 분변으로부터 분변 지표 세균을 분리동정하였고 그 결과를 <Table 3>에 나타내었다. 분변 지표 세균은 총 251균주가 분리되었으며 E. coli는 197균주, E. faecalis은 54균주가 분리되었다.

<Table 3>

Number of bacteria isolated from Fish farm and Inland pollutions

시료별로 분리된 세균의 특징을 살펴보면 가축 분변시료인 소 및 닭 분변에서 각각 39균주, 54균주가 분리되었으며, 인근 하천수 상류 및 하류에서 각각 63균주, 52균주가 분리되었다. 그리고 양식장에서 채취한 어류 (조피볼락 및 참돔)에서 43균주가 분리되었다.

E. coli는 어류 양식장과 육상 오염원에서 다른 분변 지표 세균 중 가장 높은 비율로 분리가 되었으며 가축 분변 시료에서 78균주, 하천수에서 89균주, 어류 양식장 시료에서 30균주가 분리되었다. 특히 어류 양식장 인근에 위치한 하천수에서 E. coli가 89균주로 다량으로 검출되었다.

시료에서 분석한 Enterococcus spp. 중에서 E. faecalis가 주로 검출되었는데 E. faecalis는 사람과 동물의 장내에서 흔히 발견되고 다양한 환경에서도 발견되며(Gilmore and Ferretti, 2003) 주로 커뮤니티 기반 감염 (community-acquired infections)이 이루어지지만, E. faecium은 주로 병원 내 감염 (nosocomial infections)에서 발견되는 결과와 유사한 것으로 확인되었다. 직접적인 오염 원인이 되는 가축 분변의 경우, 닭 분변에서만 E. faecalis가 검출되었는데 이는 Cho et al.(2006)에서 보고한 것과 같이 닭 분변 유래 Enterococcus spp. 분석 결과 E. faecalis가 52종, E. faecium이 25종이 검출되어 E. faecalis가 우점하는 것으로 분석된 것과 유사한 결과를 나타내었으며, 「2022년 국가 항생제 사용 및 내성 모니터링(동물, 축산물)」에 따르면 가축 분변의 Enterococcus spp. 분석 결과 소와 닭 분변에서 E. faecalis가 소 분변 2,616개 시료 중 110균주(4.2%), 닭 분변 1,751개 시료 중 172균주(9.8%)가 검출된 것과 같이 닭 분변에서 검출률이 높은 것과 유사한 결과로 확인된다.

2. 대장균과 장구균의 항생제 내성 패턴 및 다제 내성

어류 양식장, 인근 하천수 및 가축 분변 시료에서 분리한 E. coli (총 197균주) 및 E. faecalis (총 54균주)를 대상으로 16종의 항생제가 농도별로 coating되어 있는 MIC panel로 감수성 시험을 실시하였으며 이에 대한 내성 결과를 <Table 4> 및 <Table 5>에 나타내었고 다제 내성을 MAR index와 함께 <Table 6> 및 <Table 7>에 나타내었다.

먼저 가축 분변시료에서 분리한 E. coli 78균주 중에서 닭 분변 시료에서 높은 내성률을 나타내었다. 닭 분변에서 분리된 E. coli는 ciprofloxacin (71.8%)에 대한 내성률이 가장 높은 것으로 확인되었으며, tetracycline (69.2%), chloramphenicol (66.7%), ampicillin (59.0%), trimethoprim/sulfamethoxazole (56.4%)에서도 높은 내성률을 나타냈다. 이외에도 colistin (20.5%), cefoxitin (7.7%)순으로 내성을 나타내었다. 이와 같은 결과는 닭 분변 유래 E. coli의 항생제 내성 패턴이 tetracycline (95.2%), ampicillin (89.2%), trimethoprim/sulfamethoxazole (53.7%), ciprofloxacin (57.1%)에서 높게 나타난 Lee et al.(2005)의 연구 결과처럼 유사한 항생제들에서 내성이 높게 나타난 것으로 확인된다. 소 분변에서 분리한 E. coli는 chloramphenicol (17.9%)에서 가장 높은 내성을 나타내었고 tetracycline (10.3%), ampicillin (7.7%), ciprofloxacin (7.7%), trimethoprim/sulfamethoxazole (5.1%), ceftazidime (2.6%), colistin (2.6%) 순으로 내성을 나타내었다(<Table 4>). 소 분변에서 항생제 내성 균주가 상대적으로 낮게 검출된 것은 「2022년 국가 항생제 사용 및 내성 모니터링(동물, 축산물)」에 따르면 축종별 항생제 전체 사용량 중에서 돼지가 55%, 닭이 14%, 소에서 9%로 본 연구에서도 소 유래 E. coli 균주에서 항생제 내성률이 낮게 분석된 것은 항생제 사용량이 다른 축종에 비해 적고 소에 비해서 닭은 사육밀도가 높기 때문에 개체 간의 항생제 내성균 확산이 활발하기 때문으로 추정된다.

<Table 4>

Antimicrobial resistance of E. coli isolates (n=197) collected from Fish farm and Inland pollution along the Korean southern coast in 2023.

하천수에서 분리한 E. coli 89균주 중에서 하류보다는 가축 사육 농장 인근에 위치한 상류에서 높은 내성률을 나타내었다. 하류에서 분리한 E. coli는 Amoxicillin/Clavulanic acid (2.6%)에서만 내성을 나타내었지만 상류에서 분리한 E. coli에서는 ampicillin (20.0%), tetracycline (20.0%), ciprofloxacin (16.0%), trimethoprim/sulfamethoxazole (12.0%), chloramphenicol (10.0%)순으로 내성을 나타내었고 닭 분변에서 나타난 항생제 내성 패턴과 유사한 것으로 확인된다(<Table 4>). 이러한 결과는 가축 농가 밀집지역 인근 하천에서 그람 음성 Enterobaceriacaea의 분포 조사를 한 결과 13종의 항생제 중 7종 이상에서 78.3%가 내성을 나타낸 것처럼 가축 농가 인근 하천에서 항생제 내성균이 높은 비율로 서식한다는 결과와 유사한 것으로 나타났다(Jang et al., 2015). 상대적으로 하류보다 상류에서 항생제 내성 균주 분리가 높게 이루어졌지만 강우가 발생할 경우 상류의 여러 오염원과 내성 균주들이 하류로 이동하여 양식장 인근까지 영향을 줄 가능성도 높다.

어류 양식장에서 분리한 E. coli 30균주는 ciprofloxacin (20.0%), tetracycline (20.0%), trimethoprim/sulfamethoxazole (20.0%)에서 가장 높은 내성률을 나타냈고, ampicillin (16.7%), chloramphenicol (3.3%)순으로 내성을 나타내었다(<Table 4>).

가축 분변 및 하천수와 같은 높은 항생제 내성률을 나타내진 않았지만, 유사한 항생제 종류에서 내성을 나타내었으며 「2022년 국가 항생제 사용 및 내성 모니터링(동물, 축산물)」의 수산용 항생제 판매 추이(사료, 병원, 필드)에도 ampicillin을 제외한 다른 항생제의 판매가 수산용으로는 없었던 것으로 보아 하천과 인접한 어류 양식장에도 육상오염원의 항생제 내성균 전파의 영향을 받는 것으로 추정된다. 그리고 ceftiofur, gentamicin, streptomycin, nalidixic acid에 대해서는 모든 분리된 E. coli 균주에서 감수성을 나타냈다.

E. faecalis는 사람을 포함한 가축의 장관 내에 보편적으로 발견되는 세균으로 E. coli와 마찬가지로 하수와 하천, 연안 등의 수계환경에서 분변지표세균으로 활용되고 있다(Masateru et al., 2015). 먼저 닭 분변시료에서 분리한 E. faecalis 15균주는 erythromycin (73.3%)에서 가장 높은 내성률을 나타내었고 Quinupristin/dalfopristin (13.3%)에서도 내성을 y1나타냈다(<Table 5>). 특히 erthromycin은 가금류 사육에서 보편적으로 사용되는 항생제로써, 닭 분변에서 분리한 E. faecalis가 tetracycline에서 98.4%, erythromycin에서 73.0%의 높은 내성율을 나타낸 Lee et al.(2005)의 연구결과와 Yoshimura et al.(2000)가 연구한 일본의 양계장에서 분리한 E. faecalis 내성률 조사에서 erythromycin 및 tetracycline에서 각각 90.0%, 94.0% 내성인 결과와 유사한 경향을나타냈다.

<Table 5>

Antimicrobial resistance of E. faecalis isolates (n=54) collected from Fish farm and Inland pollution along the Korean southern coast in 2023.

앞서 서술한 E. coli 균주와 유사하게 E. faecalis 균주도 가축 사육시설과 인접한 상류에서 비슷한 내성 패턴을 나타내었다. 닭 분변처럼 하천 상류에서 분리한 E. faecalis 균주는 erythromycin (30.8%)에서 가장 높은 내성률을 나타내었고 linozolid (7.7%), tetracycline (7.7%), vancomycin (7.7%)순으로 나타났다(<Table 5>).

어류에서 분리한 E. faecalis 13균주도 닭 분변, 하천 상류에서 가장 높은 항생제 내성률을 나타낸 erythromycin (23.1%)에서 상대적으로 높은 내성률을 나타내었다(<Table 5>).

이러한 시료들이 종류마다 여러 환경인자(생활하수, 농업용수, 축산폐수, 하수처리장 배출수, 야생동물 등)로부터의 오염 가능성이나 유래에서 차이가 있을 수 있음에도 불구하고 상당히 유사한 항생제 내성 패턴이 나타났다.

다양한 항생제의 오·남용은 다제내성균 (multiple antimicrobial resistance bacteria, MARB)의 주요 원인 중 하나로 질병 치료를 어렵게 만들고 공중보건, 경제적으로 심각한 위협이 되고 있다(WHO, 2014; Lee et al., 2019).

가축 분변에서 분리된 E. coli 중 모든 항생제에 감수성을 나타내는 균주는 35균주 (44.9%)이었으며, MAR index가 0.2 이상으로 나타난 균주는 10균주 (12.6%)로 이 중 4개의 항생제에 내성을 가진 균주가 8균주 (10.3%)로 가장 많았고, 5개의 항생제에 내성을 가진 균주도 2균주 (2.3%)이었다. 하천수에서 분리된 E. coli는 89균주 중 6개의 균주 (6.7%)는 MAR index가 0.2 이상, 즉 4종 이상 항생제에 대해 내성을 나타냈고 이중 1균주는 가장 많은 항생제(8개)에 내성을 나타내 MAR index가 0.5으로 나타났다. 그리고 어류 양식장에서 분리한 E. coli 균주 30균주 중에서 5균주 (16.6%)가 4종 이상 항생제에 대해 내성을 나타내어 다른 시료들에 비해 다제내성균주의 비율이 높은 것으로 확인된다(<Table 6>).

<Table 6>

Patterns and indexes of multiantibiotic resistance (MAR) of E. coli isolates (n=197) collected from Fish farm and Inland pollution along the Korean southern coast in 2023.

E. faecalis에 대한 다제내성률을 확인한 결과 내성률은 가축 분변에서 E. coli보다 높게 나타났지만 MAR index가 0.2를 초과하는 다제내성을 나타낸 균주는 확인되지 않았고 하천수와 어류 양식장 시료도 상대적으로 낮은 다제내성을 나타냈다(<Table 7>). 이와 같은 결과는 Michael et al.(2015)의 미국 아이오와주 소 사육시설의 폐수 처리시스템에서 MARB 분포 조사한 결과, E. coli와 Enterococcus spp.의 다제내성균이 각각 22.3%와 36.6%로 관찰된 결과와 상반된 것으로 나타났다.

<Table 7>

Patterns and indexes of multiantibiotic resistance (MAR) of E. faecalis isolates (n=54) collected from Fish farm and Inland pollution along the Korean southern coast in 2023.

Ⅳ. 결 론

본 연구에서는 경남 거제시 둔덕면에 위치한 해상 양식장에서 채취한 어류 (참돔 및 조피볼락), 양식 해수, 인근 하천수 및 가축 분변 (소 및 닭)에서 분변 지표 세균(E. coli 및 Enterococcus spp.)의 오염도를 조사하고, 이들 균주의 항생제 내성 패턴을 분석하였다.

총 251개의 균주 (E. coli 197균주 및 Enterococcus spp. 54균주)가 검출되었으며 분리된 균주들은 다양한 항생제에 대해 내성을 나타냈으며, 가축 분변과 인접 하천수에서 높은 항생제 내성률이 관찰되었다. 특히 닭 분변에서 분리된 E. coli는 ciprofloxacin, tetracycline, chloramphenicol, ampicillin, trimethoprim/sulfamethoxazole에서 높은 내성률을 나타내었으며 인접한 하천수와 해상 양식장에서 유사한 패턴의 항생제 내성이 확인되었다. 또한, 가축 분변에서 분리된 E. coli에서 MAR index가 0.2 이상으로 나타난 균주는 10균주 (12.6%)로 다제내성이 높게 나타났다.

이러한 연구 결과는 가축 분변과 인접 하천수는 해상 양식장의 위생 상태와 항생제 내성균 확산에 영향을 미치는 중요한 오염원이 될 수 있음을 확인하였으며 항생제 내성균의 확산을 막기 위한 효과적인 관리 방안을 제안하는 데 중요한 기초 자료를 제공하였다. 향후 연구에서는 육상 오염원에 대한 장기적인 모니터링과 다양한 항생제 내성 유전자(antibiotic resistant genes, ARG)의 분석이 필요할 것으로 판단된다.

Acknowledgments

이 논문은 2023년도 국립수산과학원 수산시험연구사업(R2023054)의 지원으로 수행된 연구입니다.

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