대서양연어(Salmo salar)에서 분리한 Aeromonas salmonicida subsp. masoucida와 salmonicida의 특성 분석

I. 서 론

대서양연어(Salmo salar)는 세계적으로 가장 인기 있는 양식 어종이며, 다양한 양식장 환경에 유연하게 적응하여, 빠르게 성장하기 때문에 상업적으로 시장가치가 높다(Heen et al., 1993; Hvas et al., 2021). 이러한 이유로 전 세계 대서양연어의 양식 생산량은 2000년에 90만 톤에서 2022년에 287만 톤까지 크게 증가하였다(FAO, 2024). 하지만, 대서양연어는 우리나라에 서식하지 않고, 양식 또한 이루어지고 있지 않아 전량 수입에 의존하고 있으며, 수입량은 2016년 27,537톤에서 2023년 43,566톤으로 크게 증가하였다(OMRC, 2024).

현재 전 세계적으로 대서양연어 양식 기술 개발을 위한 다양한 연구가 수행 중이며, 특히 질병을 극복하기 위한 많은 연구가 보고되고 있다. 하지만 국내 환경에서 대서양연어를 사육할 경우 발생하는 질병의 특성에 관한 연구는 미비한 실정이다. 대서양연어에 주로 발생하는 바이러스성 질병은 전염성연어빈혈증(Infectious salmon anaemia virus, ISAV), 연어알파바이러스(Salmon alphavirus, SAV), 전염성조혈기괴사증(Infectious haematopoietic necrosis virus, IHNV), 전염성췌장괴사증(Infectious pancreas necrosis virus, IPNV)등이 있으며, 세균성 질병은 피시리케치아증(Piscirickettsia salmonis), 냉수성비브리오증(Aliivibrio salmonicida), 절창병(Aeromonas salmonicida), 세균성 신장병(Renibacterium salmoninarum)등이 있고, 아가미 아메바충(Neoparamoeba perurans)과 같은 기생충성 질병, 물곰팡이(Saprolegnia parasitica)와 같은 진균성 질병이 있다(Cipriano and Miller, 2003; Cvitanich et al., 1991; Deveney and Scott, 2008; Godoy et al., 2008; Graham et al., 2012; Jee et al., 2007; Nelson et al., 1995; Pettersen et al., 2015; Woo et al., 2022).

다양한 세균성 질병 중에서 Aeromonas salmonicida는 19세기 말 독일의 브라운 송어(Salmo trutta)에서 처음 보고되었으며, 현재까지 전 세계 양식산업에서 가장 문제가 되는 어류 세균성 질병 중 하나이다(Emmerich and Weibel, 1894; Fajardo et al., 2023; Librán-Pérez et al., 2018; Magariños et al., 2011). A. salmonicida는 Proteobacteria문, γ-Proteobacteria강, Aeromonadales목, Aeromonadaceae과에 속하며, 비운동성 그람음성균으로 알려졌다(Austin and Austin, 2016; Colwell et al., 1986; Figueras, 2005; Zdanowicz et al., 2020). A. salmonicida는 출혈성 및 궤양성 질병을 일으키는 절창병의 원인균으로써, 주로 연어과 어류인 대서양연어(Salmo salar), 무지개송어(Oncorhynchus mykiss)등을 감염시켜 높은 폐사율을 유발한다(Austin and Austin, 2012; Gulla et al., 2019; Yan et al., 2021).

염기서열의 상동성이 높은 A. salmonicida의 아종을 동정하기 위해서는 일반적으로 사용하는 16S rRNA 유전자보다는 vapA (A-layer) 유전자를 사용하여 정형과 비정형 균주를 구별한다(Bakiyev et al., 2023; Gulla et al., 2016; Martínez-Murcia, 1999). 또한, 이전 연구에 따르면 생화학적 특성 중에서 indole 생산, esculin 분해, glucose 발효, acetoin 생산 반응 등을 통해 A. salmonicida의 정형과 비정형 균주를 구별하면 유용하다고 하였다(Dalsgaard et al., 1998; Wiklund and Dalsgaard, 1998).

A. salmonicida는 salmonicida, masoucida, acromogenes, pectinolytica, smithia의 5개 아종을 가지고 있으며, 생화학적 특징, 표현형 또는 형태학적 특징에 따라 정형, 비정형으로 나뉜다(Austin et al., 1989; Hirvelä and PerttuJisju, 1994; Pradhan et al., 2023). 연어류에서 가장 많이 발견되는 A. salmonicida subsp. salmonicida는 정형으로 구분되고(Daher et al., 2011; Wang et al., 2020), 패혈증과 급성 폐사를 일으키기도 하며, 만성 형태로 근육조직에 종기가 발현되는 종기증(furunculosis)의 원인균으로 알려져 있다(Austin and Austin, 2012; Daher et al., 2011; Pradhan et al., 2023; Reith et al., 2008; Wang et al., 2020). 비정형인 A. salmonicida subsp. masoucida, acromogenes, pectinolytica, smithia는 연어류 이외에도 조피볼락(Sebastes schlegeli), 붕어(Carassius carassius), 강도다리(Platichthys stellatus)등 다른 어류도 감염을 일으킨다(Bjarnheidur and Bryndis, 2017; Han et al., 2011; Han et al., 2017). 주요 증상으로는 피부 변색부터 체표 궤양, 근육 괴사 등 다양하게 일어나며, 발병 기전은 정확하게 알려지지 않았다(Noga, 2010; Wang et al., 2020). 세계적으로 대서양연어의 세균성 질병 중에서 가장 큰 피해를 주는 A. salmonicida subsp. salmonicida에 초점을 맞춰 연구가 진행되었지만, 최근에는 A. salmonicida subsp. masoucida로 인한 경제적 피해를 보는 사례가 늘어가고 있다(Du et al., 2015; Du et al., 2018). 국내의 경우 무지개송어, 대서양연어, 첨연어, 은연어, 강도다리 등에서 A. salmonicida 아종으로 인한 폐사가 보고된 바 있다(Lim et al., 2017; Lim et al., 2023; Woo et al., 2022).

본 연구에서는 2023년부터 현재까지 강원지역에서 사육한 대서양연어의 질병 모니터링 수행 중 분리된 Aeromonas salmonicida 21균주의 생화학적 특성 및 수산용 항생제에 대한 내성을 분석하였으며, 이를 통해 국내 연어양식 산업발전에 필수적이라 할 수 있는 백신을 개발하기 위한 기초자료를 확보하고자 한다.

Ⅱ. 연구 방법

2. 세균 동정

순수 분리한 세균은 Accuprep® Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer, Seoul, Korea)를 이용하여 DNA를 추출하였다. 분리된 세균은 1차로 16S rRNA 유전자의 염기서열 분석을 통해 동정하였으며, 2차로 vapA 유전자의 염기서열 분석을 통해 아종을 동정하였다(<Table 1>). PCR을 위해 Accupower® PCR PreMix (Bioneer, Seoul, Korea)를 사용하였으며, forward primer와 reverse primer 각각 1 μL, RNase free water 17 μL, template 1 μL를 혼합하여 총 20 μL가 되도록 수행하였다. 16S rRNA 유전자를 증폭시키기 위한 PCR 조건은 94℃ 5분; 94℃ 30초, 53℃ 30초, 72℃ 1분을 40 cycle; 72℃ 7분 반응하였다. vapA 유전자를 증폭시키기 위한 PCR 조건은 95℃ 5분; 95℃ 30초, 50℃ 30초, 72℃ 1분을 30 cycle; 72℃ 7분 반응하였다. 증폭된 PCR product는 1.5% agarose gel에서 전기영동하여 밴드를 확인한 후, 시퀀싱을 통해 염기서열을 분석하였다. 분석된 염기서열은 NCBI의 BLAST를 이용하여 동정하였다.

<Table 1>

PCR primer used in this study

4. 항생제 최소억제농도 측정

항생제 최소억제농도 측정을 위해 수산용 항생제를 농도별로 단계 희석한 제품인 KRAQ3, KRAQ4 (TREK Diagnostic System Ltd, East Grinstead, UK) 패널을 이용하였다(<Table 2>). 배양된 균주의 콜로니를 취하여 멸균 생리식염수에 현탁하고 0.5 McFarland로 맞춘다. 현탁액은 CAMHBT (cation adjusted Mueller-Hinton broth with TES, TREK Diagnostic System Ltd, East Grinstead, UK) broth에 5x10⁵ CFU/mL가 되도록 희석하였다. 그 후 항생제 감수성 검사 패널에 희석된 균주액 100 μL를 접종한 후, 밀봉하여 28℃에서 24시간 배양한다(CLSI, 2020). 배양 후 Sensitire® Manual Viewer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)로 세균 증식이 억제된 항생제 농도를 최소억제농도(MIC, Minimum inhibition concentrations)로 판독하였다.

<Table 2>

Antibiotic susceptibility testing panels (KRAQ3 and KRAQ4); antibiotic types and concentration ranges

Ⅲ. 연구 결과

1. 분리 세균 동정

총 67마리의 대서양연어에서 분리된 세균을 16S rRNA 유전자로 동정한 결과, 21마리에서 A. salmonicida가 분리되었으며, 이들의 외부증상으로는 체색흑화, 안구탈락, 지느러미 발적·괴사·출혈, 다발성 체표 궤양 등이 관찰되었다. 분리된 A. salmonicida를 vapA 유전자로 동정한 결과, A. salmonicida subsp. masoucida (ASM)는 11균주, A. salmonicida subsp. salmonicida (ASS)는 10균주가 분리되었다. TSA 배지에서 20℃, 48시간 배양하였을 때 ASS 균주들만 갈색 색소를 생성하는 것을 확인하였다(<Table 3>).

<Table 3>

Results of the analysis of various biochemical properties of Aeromonas salmonicida subsp. masoucida and Aeromonas salmonicida subsp. salmonicda

2. 생화학적 특성

API 20NE, API 20E, API ZYM, oxidase, catalase, casein hydrolysis, anaerobic, hemolysis를 통한 생화학적 특성 분석 결과, ASM 11균주 모두 통성 혐기성세균으로, oxidase, catalase, casein hydrolysis와 hemolysis에 대하여 모두 양성반응을 보였다. ASS 10균주 모두 통성 혐기성세균으로, oxidase, casein hydrolysis와 hemolysis는 모두 양성반응을, catalase에 대해서는 일부 균주에서만 양성반응을 보였다(<Table 3>).

API 20E의 분석 결과, ASM은 indole, acetoin, gelatinase, mannitol fermentation, saccharose fermentation 항목에서 11균주 모두 양성으로 확인되었고, ASS는 acetoin, gelatinase, mannitol fermentation 항목을 제외하고 모두 음성으로 확인되었다(<Table 4>). API 20NE의 분석 결과, ASM은 NO3, indole, β-glucosidase, gelatin 항목에서 11균주 모두 양성으로 확인되었다. ASS는 NO3 항목만 양성으로 확인되었다(<Table 5>). API ZYM의 결과 표시는 색의 변화 정도에 따라 0~5까지 표시하지만, 본 연구에서는 + (positive reaction), - (negative reaction), w (weakly positive reaction)로 표시하였다. ASM은 alkaline phosphatase, esterase, esterase lipase, leucine arylamidase, β-glucosidase 항목에서 11균주 모두 효소 활성을 보였다. ASS는 alkaline phosphatase, esterase, esterase lipase, lipase, leucine arylamidase 항목에서 10균주 모두 효소 활성을 보였다(<Table 6>).

<Table 4>

Biochemical properties analysis results of Aeromonas salmonicida subsp. masoucida and Aeromonas salmonicida subsp. salmonicda (API 20E kit used)

<Table 5>

Biochemical properties analysis results of Aeromonas salmonicida subsp. masoucida and Aeromonas salmonicida subsp. salmonicda (API 20NE kit used)

<Table 6>

Biochemical properties analysis results of Aeromonas salmonicida subsp. masoucida and Aeromonas salmonicida subsp. salmonicda (API 20 ZYM kit used)

3. 항생제 최소억제농도

ASM 11균주와 ASS 10균주를 대상으로 수산용 항생제 19종에 대한 최소억제농도를 측정하였다(<Table 7, 8>). ASM 11균주 모두 clindamycin (16 μg/mL<), cephalexin (64 μg/mL<), amoxicillin (16 μg/mL<), ampicillin (128 μg/mL<), amoxicillin/ clavulanic acid (8 μg/mL<)에 대하여 내성을 가졌으며, trimethoprim/sulfadiazine (≤0.12-0.25 μg/mL), neomycin (1-4 μg/mL), florfenicol (0.25-2 μg/mL)에 대하여 감수성을 가졌다. ASS 10균주 모두 clindamycin (8-16 μg/mL<), oxytetracycline (64-128 μg/mL<), doxycycline (16-32 μg/mL<), nalidixic acid (64 μg/mL<)에 대하여 내성을 가졌으며, enrofloxacin (≤0.03-0.12 μg/mL), ampicillin (≤0.25-2 μg/mL<), ceftiofur (0.06-0.5 μg/mL), trimethoprim/sulfadiazine (≤0.12-0.5 μg/mL), oxolinic acid (≤0.5-2 μg/mL), ciprofloxacin (0.06-0.25 μg/mL), neomycin (≤0.5-2 μg/mL), gentamicin (≤0.12-0.5 μg/mL), florfenicol (1-2 μg/mL)에 대하여 감수성을 가졌다.

<Table 7>

Minimum inhibitory concentration (MIC) results for Aeromonas salmonicdia subsp. masoucida and Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida using the KRAQ3 aquaculture antibiotic panel

<Table 8>

Minimum inhibitory concentration (MIC) results for Aeromonas salmonicdia subsp. masoucida and Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida using the KRAQ4 aquaculture antibiotic panel

Ⅳ. 결 론

현재 전 세계적으로 양식 어류의 질병을 치료하는 방법으로 항생제를 사용하고 있지만, 항생제에 대한 세균의 내성이 빠르게 발달하고 있는 동시에 어체내에 항생제 축적 문제로 인해 항생제 사용이 매우 제한적이다(Coscelli et alk., 2015; Dallaire-Dufersne et al., 2014; Fajardo et al., 2023; Vega-Sánchez et al., 2014). 항생제를 대신하여 세균을 통제하기 위해 백신, probiotics, prebiotics, 면역증강제가 포함된 사료첨가제, 선택적 육종 등 다양한 방법이 연구되었다(Cipriano et al., 2002; Menanteau-Ledouble et al., 2016; Ødegåd et al., 2007; Villumsen et al., 2015). 현재 전 세계적으로 다양한 연어류 예방 백신이 상용화되었으며, 백신 사용으로 인해 세균성 질병 억제 및 항생제로 인한 문제가 해결된 바 있다(Bustos et alk., 2023; Mondal H and Thomas John, 2022; Piotrowska M and Popowska, 2014). 이에 따라 국내 환경에 맞는 백신을 상용화하기 위해 다양한 병원체 분리와 특성 분석이 필요하다.

ASM이 분리된 대서양연어는 체색흑화, 안구탈락, 배지느러미 발적의 외부증상이 관찰되었다. ASS가 분리된 대서양연어는 꼬리·가슴·복부지느러미 출혈·괴사, 복부 출혈, 체표 궤양, 다발성 체표 궤양의 외부증상이 관찰되었다(data not shown). 이러한 결과로 볼 때, ASM보다 ASS에서 다양한 외부증상이 관찰되었으며, ASM에서는 체표 궤양이 발견되지 않았다.

Al-Mokaddem et al.(2022) 에 따르면 배양학적 특성에서 A. salmonicida의 정형과 비정형의 가장 큰 차이가 갈색 색소의 형성 유무라고 하였다. 본 연구에서도 분리된 균주 중에서 ASS만 갈색 색소를 형성하였다(Table 3). 하지만 Lian et al.(2020)는 노르웨이의 대서양연어와 중국의 양식 붕어에서 분리된 ASS에서 갈색 색소를 형성하지 않는다고 하였다. 하지만 본 연구에서는 아종에 따라 갈색 색소의 형성이 확연히 구분되었으며, 이러한 결과로 A. salmonicida의 아종을 분리하는 지역, 어종, 환경 등에 따라 특성이 다른 것으로 사료된다.

기존의 연구에 따르면 비정형 A. salmonicida는 esculin을 가수분해한다고 보고되었지만(Godoy et al., 2010; Koski et al., 1994), Dalsgaard et al.(1998)은 대부분의 비정형 A. salmonicida는 esculin을 가수분해하지 않는다고 보고하였다. 본 연구에서는 esculin을 가수분해하였고(<Table 5>), glucose의 발효는 일부 균주에서 양성을 보였다. API ZYM의 결과 두 균주 모두 α-galactosidase, β-glucosidase, α-glucosidase, α-mannosidase, α-fucosidase에서만 효소 활성이 없었다. 그에 반해 alkaline phoshatase, esterase, esterase lipase, leucine arylamidase에서 두 균주 모두 효소 활성이 있었다.

Han et al.(2011)에 따르면 같은 균주여도 분리원이 다르면 생화학적 특성이 다르다고 설명하였으며, 생화학적 특성의 결과만으로는 정확한 균주 동정이 어렵다고 하였다. 본 연구에 사용된 균주 또한 같은 종의 균주임에도 분리된 장소, 시기에 따라 생화학적 특성이 다른 것을 확인하였다. 그러므로 분리된 균주의 특성을 파악하기 위해서는 다양한 생화학적 특성 분석이 필요하다고 생각된다.

육상 동물, 인간에게 질병을 일으키는 세균성 질병에 대한 항생제의 감수성과 내성을 판단할 수 있는 기준에 관한 연구가 많이 이루어졌지만, 어류 질병세균에 관한 항생제 내성 기준이나 판단에 대한 정확한 기준이 모호한 실정이다(Kim et al., 2020). Kim et al.(2020)에 따르면 국제 프로토콜인 CLSI (clinical and laboratory standards institute) 가이드라인 중에서 어류 질병세균용으로 마련된 국제표준 방법인 VET03/VER04-S2에조차 A. salmonicida만 항생제에 대한 해석기준이 작성되어 있다고 한다(CLSI, 2014). 이러한 이유로 다양한 어류 질병세균에 대한 특성 및 항생제 관련 연구가 필요하다. 본 연구에서는 ASM은 penicillin계 항생제에 내성을 많이 가졌고, ASS는 tetracycline계 항생제에 내성을 많이 가졌다(<Table 7, 8>). McIntosh et al.(2008)은 A. salmonicida 아종이 항생제에 대하여 내성을 가지는 일은 흔하며, 이는 항생제 내성 유전자를 운반하는 플라스미드에 의한 것이라고 설명하였다. A. salmonicida 아종이 tetraycline계 항생제에 대한 내성 연구와 감수성 연구가 보고되었지만(Fernández-Álvarez et alk., 2016; Pradhan et al., 2023), 다양한 수산용 항생제에 대한 연구는 미비하다. 이러한 이유로 세균의 치료를 위해 백신과 천연물을 이용한 치료제에 대한 연구가 필요하다.

현재 국내 대서양연어 양식 기술 개발이 진행되고 있는 가운데, 이번 연구는 대서양연어에서 분리한 A. salmonicida subsp. masoucida와 salmonicida에 대하여 생화학적 특성과 수산용 항생제에 대한 내성 분석을 진행함으로써, 백신 개발에 기초가 되는 자료를 확보하였다. 추후 국내 맞춤형 백신 개발을 위해 추가적인 병원체 수집과 특성 분석이 수행되어야 할 것으로 생각된다.

Acknowledgments

이 연구는 국립수산과학원 연어류 예방양식연구(R2024062)의 지원에 의해 진행되었습니다.

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