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본 연구에서는 2015년 경남 남해군 양식 돌돔에서 분리된 RSIV strain(ADC-RSIV2015-021)을 실험에 이용하였다. 돌돔의 비장조직을 마쇄하여 L-15(SIGMA)에 현탁하고, 13,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상층액을 취하였다. 이를 PMF cell(L-15 with 1% penicillin/streptomycin and 5% FBS)에 100 μl 접종하고, 25℃에서 7일 후 Cytopathic effects(CPE)를 확인하고, 10일째 상층액을 회수하여 1 ml씩 –80℃에 보관하였다.

RSIV의 정량 분석은 Caipang et al.(2003)의 SYBR Green method에 따라 분석 하였다. 정량분석을 위해 RSIV 배양 상층액 300 μl에서 High pure PCR template Preparation kit(Roche, Swiss)를 이용하여 genomic DNA를 추출하고, MCPL primer set <Table 1>을 이용하여 증폭하였다. 429 bp의 PCR 산물은 pGEM T-easy Vector System I (Promega, USA)와 Escherichia coli JM109를 이용하여 클로닝 하였다. Hybrid-Q Plasmid Rapidprep kit를 이용하여 plasmid를 추출하였으며, 추출된 plasmid는 NanoVue (GE Healthcare, USA)를 이용하여 농도를 측정한 뒤 아래의 식을 이용해 표준 시료의 copy No.를 산출하였다.

Number of copies = (amount of ssRNA in nanograms × 6.022 × 10²³) / (length of ssRNA in basepairs × 1 × 10⁹ × 330)

표준 시료의 검량곡선을 산출하기 위하여 10^-7배까지 단계희석 한 plasmid DNA를 qPCR분석을 이용하여 Ct값을 측정 하였다. qPCR은 QIAgen QuantiTect SYBR green PCR kit(Germany)와 희석된 plasmid, primer를 첨가한 후, PCR반응 조건은 50℃에서 2분, 95℃에서 15분 initial denaturation 후, 95℃에서 15초 denaturation, 55℃에서 30초 annealing, 72℃에서 30초간 extension의 반응을 40 cycles로 수행하였다. 최종적으로 측정된 Ct값으로 표준 검량곡선을 산출 하였다.

Plasmid DNA copy 값(x)에 대한 Ct 값(y)의 표준 회귀식은 y = -3.368 × x + 35.778 를 이용하였다([Fig. 1]). Caiping et al.(2003)의 연구 결과에서 특이 primer를 이용하여 117.6 copies/5μl 범위 까지 검출되었다. 본 연구에서 Ct값 35에서 1.7 copies/rxn 까지 검출이 확인되었으며, 안정성과 신뢰성을 고려하여 Ct값 32 (1.6 × 10 copies/rxn)를 cut-off value로 설정하였다.

[Fig 1] 
Analysis of a qPCR assay performed in triplicate on aliquots of plasmid DNA containing the Megalocytivirusmajor capsid protein gene (MCP), serially diluted 10-fold. (a) Amplification plot of the real-time PCR assay. (b) The standard curve was obtained by regression analysis of cycle threshold values versus initial plasmid copy numbers.

돌돔, 감성돔, 조피볼락 및 넙치를 각각 18℃와 28℃ 수조에 순치하고 RSIV를 10⁵ copies/fish의 농도로 복강주사 1일, 3일, 5일, 1주, 2주 및 3주 후 비장을 적출하여 조직 내 바이러스 정량분석 및 병리조직학적 분석을 수행하였다. 28℃ 돌돔에서 감염 5일 후부터 비장 조직내 RSIV는 1 × 10³ copies/mg으로 검출되었고, 7일(9 × 10⁶ copies/mg) 후 급격하게 증가하여 접종 14일(9 × 10⁹ copies/mg) 후 가장 높게 나타났으며([Fig. 3b]) 이후 돌돔(28℃)은 전량 폐사 하였다(Fig 2b). 18℃ 돌돔에서는 접종 14일 후 8 × 10³ copies/mg 그리고 21일 후 2 × 10³ copies/mg 으로 나타났다([Fig. 2a]).

[Fig 2] 
(a) Cumulative mortality of rock bream injected intraperitoneally (IP) with serially diluted RSIV(107 copies/fish ~ 102 copies/fish) at 28℃. Cumulative mortality of rock bream (b), black porgy (c), rockfish (d) and olive flounder (e) injected intraperitoneally (IP) with 10⁵ copies/fishof RSIV at difference water temperature 18℃and 28℃.

[Fig 3] 
Quantitative analysis of RSIV genome copies was performed in the spleen of rock bream, black porgy, rockfish and olive flounder after 1~21 dpi of challenge with RSIV(10⁵ copies/fish) at difference water temperature (a) 18℃ and (b) 28℃.

돌돔에서 RSIV 인위감염 후 폐사율을 분석한 결과 28℃ 돌돔에서 인위감염 4일 후부터 폐사가 발생하기 시작하여 17일 후에 전량 폐사 하였으나, 18℃ 수조에서는 폐사가 발생하지 않았다. 또한 18℃수조의 돌돔 비장에서 인위감염 14일 후 가장 높은 바이러스 copies(10³/mg)가 검출되었는데, 이러한 결과는 돌돔에서 RSIV는 저수온에서도 바이러스 복제(virus replication)가 일어난다는 것을 의미한다(Kim et al., 2022). 그러나 저수온(18℃)에서 돌돔의 폐사율 분석 결과로 미루어, 저수온 환경에서 RSIV는 돌돔에 폐사를 초래할 만큼의 충분히 복제하지 못한 것으로 예상된다. 병리조직학적 분석에서 돌돔은 18℃의 전구간에서 이형비대세포가 발생하지 않았으며, 림프구 침윤 소견이 우점적으로 나타났다([Fig. 4]). 28℃의 14일에서 이형비대세포의 출현이 관찰되었으며, 인근의 ellipsoid의 응고괴사, 대식세포의 포식활성 증가에 따른 공포화 소견이 나타났다([Fig. 4]).

[Fig. 4] 
Histopathological observation of spleen in Rock bream after 14 day post-injection with 18℃ and 28℃. lymphocytic infiltration (white arrows) in treatment groups compared with control groups at 18℃; coagulative necrosis of ellipsoid (black ellipse), vacuolation of macrophage associated with phagocytosis (black arrowheads) and megalocytic inclusion bodies (red arrowheads) in treatment groups at 28℃.

특히, 조직병리학적 소견에서 이형비대세포가 첫 번째로 출현하는 구간인 7일과 14일 사이 기간에 돌돔의 폐사량이 급증하는 것으로 RSIVD 증상의 발현과 폐사량이 연관이 깊은 것으로 나타난다. 돌돔은 17℃미만의 수온에서 RSIV에 대한 감수성이 현저히 낮으며(Jung et al., 2015), RSIV 복제를 위한 적절한 온도범위는 20~25℃로 보고되었다(Oh et al., 2016; Jung et al., 2017). 이러한 결과는 RSIV의 병원성이 수온에 의존적으로 발현한다는 연구결과와 일치한다(Jun et al., 2009; Jung et al., 2015; Kim et al., 2022).

한편 돌돔 이외 감성돔, 조피볼락 및 넙치의 인위감염 후 폐사율분석 결과 모든 시험구(18℃, 28℃)에서 폐사가 나타나지 않았으며([Fig. 2c, d and e]), 비장 내 RSIV 정량분석 결과 모든 시험구에서 검출한계 미만으로 나타났다([Fig. 3]). 이전연구에서 이리도바이러스 인위감염 후 조피볼락(환수율: 50%/day) 및 넙치(환수율: 20%/day) 조직내 바이러스 검출이 보고되었다(Jung et al., 2016; Min et al., 2021). 이러한 결과로 미루어 수조 크기 및 환수율 등 조건에 따라 인위감염 후 조직 내 바이러스 보균량이 달라질 수 있을 것으로 예상된다.

병리조직학적 분석결과에서 18℃ 및 28℃ 전구간에서 샘플링한 감성돔, 조피볼락, 넙치 RSIV 접종 군들은 모두 이형비대세포가 확인되지 않았으나, Control 군과 대조하여 림프구의 침윤, ellipsoid 비후, MMC 생성증가 소견이 나타났다([Fig. 5a, b and c]). 림프구의 침윤은 virus 침입에 대한 숙주 면역반응으로 초래된 것으로 보여지며(Ramos-Casals et al., 2001), 염증반응이 지속되며 ellipsoid 비후 및 MMC 형성이 나타난 것으로 예상된다(Agius and Roberts, 2003; Han et al., 1995). 감성돔 및 조피볼락은 RSIV에 대한 병원성이 돌돔에 비하여 없거나 낮은 수준으로 보고되었으며(Jeong and Jeong, 2008; Choi et al., 2010; Kwon et al., 2015), 넙치(Do et al., 2005), 가자미 및 쥐치(Jo et al., 2009) 등 에서 RSIV의 검출이 보고되었으나, 병원성에 대한 연구는 여전히 부족한 실정이다.

[Fig. 5] 
Histopathological observations of the spleen in black porgy (a), rockfish (b), olive flounder (c) after 14 days following infection at temperature of 18 ℃ and 28 ℃. (a) increased Melano-macrophage center (white arrowheads) and ellipsoidal enlargement (black arrows) in RSIV-infected black porgy, (b) ellipsoidal enlargement (black arrows) and lymphocytic infiltration (white arrows) in RSIV-infected rockfish, (c) ellipsoidal enlargement (black arrows) and lymphocytic infiltration (white arrows) in RSIV-infected rockfish.

본 연구에서 수온에 따른 주요 양식품종에 대한 RSIV의 병원성 분석을 수행하였다. 돌돔에서 RSIV는 고수온(28℃)에 의존적으로 병원성을 확인할 수 있었으나, 감성돔, 조피볼락 및 넙치는 고수온(28℃) 및 저수온(18℃)에서 RSIV 인위감염 및 병리조직학적 분석 결과 병원성을 확인할 수 없었다.