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따개비는 해양 환경에서 다양한 기질(substrate)에 부착하여 서식하는 특성이 있으므로, 조직 손상을 최소화하기 위해 송곳, 굴칼(oyster knife), 스크래퍼(scraper) 등 적절한 도구를 사용하여 신중하게 분리하여야 한다. 시료는 염색성 저하 및 조직 손상을 방지하기 위해 살아있는 개체 또는 폐사 후 5분 이내의 자가융해(autolysis)가 일어나지 않은 상태의 개체만을 사용해야 한다(Reagan et al., 2011). 따개비는 개폐판 아래에 연조직이 위치하지만, 개폐판이 닫힌 상태가 대부분이어서 외형만으로 생사 판별이 어렵다. 채집 후 개폐판을 부드럽게 눌러 내부 상태를 확인하면, 살아 있는 개체는 근육 저항으로 개폐판이 쉽게 눌리지 않으나, 이미 폐사한 개체는 조직이 부패되어 개폐판이 아래로 함몰된다. 이 방법을 통해 살아 있는 개체를 효과적으로 선별할 수 있다.

본 연구에서는 따개비의 석회질 외골격을 효과적으로 제거하기 위하여 Leica Biosystems사의 Decalcifier II 제품을 주 탈회제로 사용하였고, 아세트산과 알코올을 1:3 비율로 혼합한 용액을 활용한 선행 연구 방법도 병행하였다([Fig. 3A-B]). 두 방법 모두 4시간 동안 탈회를 진행한 결과, 외골격의 탈회에는 일정 수준 효과를 보였다. 탈회 후 연조직 분리 과정에서 Decalcifier를 사용한 시료는 외골격이 거의 완전히 연화되어 연조직 분리가 용이했으나([Fig. 3C]), 아세트산 혼합액을 사용한 시료는 외골격이 상대적으로 온전하게 남아 있어 연조직 분리에 더 많은 시간이 소요되었다([Fig. 3D]).

[Fig. 3] 
Comparison of decalcification methods for barnacle samples. (A) Decalcifier II product (Leica Biosystems). (B) Acetic acid and ethanol mixed solution (1:3 ratio). (C) Barnacle sample after treatment with Decalcifier II, showing extensive decalcification. (D) Barnacle sample after treatment with the acetic acid–ethanol solution, showing partial decalcification. Scale bar = 1cm.

Davidson’s solution은 아세트산(acetic acid)을 포함해 세포 성분의 팽창을 유도하지만, 알코올과 포르말린이 단백질을 수축시켜 이러한 효과를 상쇄한다(Haschek et al., 2013; Jalali et al., 2023). 또한 핵산 손상이 적고, 탈회 효과도 함께 제공되어 단단한 외골격을 지닌 갑각류 조직의 고정에 효과적이다(Edgerton, 2014). Davidson’s solution의 조성과 각 성분의 용량은 다음 표에 제시하였다(<Table 1>). Stock solution은 냉장 보관하며, 실험 시에는 Stock solution과 아세트산을 9:1의 비율로 혼합해 working solution으로 사용한다(<Table 1>). 시료는 고정액에 충분히 잠기도록 하고, 시료 부피의 최소 20배 이상의 고정액을 사용하는 것이 권장된다(Howard et al., 2004). 이는 고정액이 조직 전반에 균일하게 침투해 고정 효과를 극대화하고, pH 변화나 고정력 저하를 방지하기 위함이다. 탈회 후 고정은 실온에서 24-48시간 동안 수행하며, 시료 크기와 조직 밀도에 따라 고정 시간을 조절해야 한다. 고정 시간이 부족하면 조직 내부까지 고정액이 충분히 도달하지 않아 염색 불균형이나 조직 붕괴가 발생할 수 있다(Suvarna et al., 2019). 이후 70% 에탄올로 치환하여 장기간 보관한다(Cho et al., 2024).

박절 단계에서 조직 내 석회질 조각이 남아있으면 마이크로톰 칼날이 손상되거나 절단면이 찢어지는 문제가 발생할 수 있다. 이를 방지하기 위해 외골격으로부터 조직을 완전히 적출해야 하며, 이 과정에서 조직 손상을 막기 위해 세심한 주의가 필요하다([Fig. 4]).

[Fig. 4]. 
Dissection of barnacle exoskeletal tissues to prevent damage during histological sectioning. (A) Initial incision into the exoskeleton and gentle separation of soft tissue using forceps. (B) Gradual detachment of soft tissue from the exoskeleton to avoid tearing. (C) Complete removal of residual tissue fragments from the exoskeleton. (D) Fully isolated tissue sample, ready for further processing.

특히 난소가 위치한 기저면(basal plate)에는 미세한 석회질 조각이 많아, 이를 하나씩 제거하는 작업이 필수적이다([Fig. 5A]). 개폐판(operculum)은 포매(embedding) 단계에서 조직을 평평하게 누르는 과정 중 유실될 수 있으므로, 사전에 제거하는 것이 바람직하다([Fig. 5B-D]).

[Fig. 5]. 
Sequential removal of calcareous fragments from the basal plate and operculum in barnacle tissue preparation. (A) Removal of minute calcareous fragments attached to the basal plate using fine forceps. (B) Initial stage of separating the operculum from the surrounding tissue, ensuring minimal damage to the soft tissue. (C) Complete removal of the operculum, exposing the underlying tissue for further processing. (D) Appearance of the tissue sample after operculum removal, with all calcareous debris eliminated and the sample ready for subsequent histological procedures.

따개비의 정소(testis)는 난소(ovary)와 달리 몸체(main body)에 위치한다. 정소 발달 단계를 관찰하려면 껍데기를 제거한 뒤 절편을 제작해야 하나, 모든 개체에서 난소와 정소가 동시에 잘 보이도록 박절하기는 어렵다.

따라서 몸체를 별도로 적출해 절편을 제작하는 것이 효율적이다. 몸체 적출 방법에는 두 가지가 있다. 첫째, 개폐판을 제거한 뒤 핀셋으로 만각을 잡고 조심스럽게 몸체를 당겨 분리하는 방법([Fig. 6]), 둘째는 기저면을 절개해 외투강(mantle cavity) 위에 위치한 몸체를 직접 꺼내는 방식이다([Fig. 7]). 전자는 정소와 난소 각각의 절편 제작이 가능하나 시간이 많이 소요되며, 후자는 보다 빠르게 정소를 적출할 수 있지만 난소는 손상되어 절편 제작이 어렵다. 따라서 관찰 목적에 따라 적절한 적출 방법을 선택하는 것이 중요하다.

[Fig. 6]. 
Stepwise method for extraction the soft body of barnacle after removal of the operculum. (A) Preparing for extraction: The cirri (feeding appendages) are gently grasped with forceps, positioning the specimen for safe removal. (B) Initial extraction: The cirri are held firmly, and gentle traction is applied to begin pulling the soft body out of the shell. (C) Careful extraction: The soft body is slowly and carefully drawn out, with attention to avoiding any tearing or damage to internal tissues. (D) Complete separation: The soft body is fully removed from the exoskeleton, exposing internal organs for subsequent histological processing.

[Fig. 7] 
Stepwise method for extracting the soft body of a barnacle by incising the basal plate. (A) Incising the basal plate to create an opening that allows access to the internal soft body. (B) Carefully separating the soft body from the shell using fine forceps, ensuring minimal damage to delicate tissues. (C) Gently extracting the soft body through the created opening, maintaining the integrity of internal structures. (D) Complete removal of the soft body, fully isolating it from the exoskeleton for subsequent histological processing.

조직 전처리는 고정된 조직을 파라핀에 포매하기에 적합하게 만드는 과정이다. 일반적으로 탈수, 투명, 침투 세 단계로 구성되며(Valle, 2022), 수동 또는 회전형 자동 침투기를 활용해 수행된다(Cho et al., 2024). 탈수 단계에서는 조직 내 잔류 고정액과 세포 내 수분을 제거하기 위해 70%, 80%, 95%, 100% 순으로 농도를 높인 알코올 용액을 사용한다.

하지만 고온 또는 고농도 알코올(95-100%)에 장기간 노출되면 과도한 탈수가 발생해 염색성 저하 및 절편 제작 시 조직 파괴가 발생할 수 있으므로 주의가 필요하다. 투명화 단계에서는 탈수에 사용된 알코올을 완전히 제거할 수 있는 자일렌(xylene)과 같은 지용성 용매를 사용한다. 이후 파라핀 침투 과정에서는 자일렌이 완전히 제거되어야 하며, 고온의 파라핀에 과도하게 노출되거나 침투 시간이 부족하면 조직의 과도한 수축 및 건조가 발생할 수 있다(Suvarna et al., 2019). 본 연구의 전처리 절차는 다음 표에 제시하였다(<Table 2>).

포매는 조직을 손상 없이 고정된 상태로 유지한 채 파라핀에 침투시켜 블록(block)을 제작하는 과정이다(Howard et al., 2004). 블록 제작에는 파라핀 디스펜서, 냉각판, 카세트 저장공간 등으로 구성된 모듈형 포매 센터가 사용된다([Fig. 8A]; Suvarna et al., 2019). 파라핀은 녹는점이 56.6°C이므로, 사용 최소 2시간 전에 포매 센터를 가동해 완전히 용해시킨다(Cho et al., 2024). 조직 전처리가 완료된 시료는 카세트 저장 공간으로 옮긴다.

[Fig. 8] 
Stepwise illustration of the paraffin embedding process for histological tissue preparation. (A) Embedding center: The modular embedding center, equipped with a paraffin dispenser, cooling plate, and cassette storage, is prepared for use. (B) Tissue placement: The tissue sample is positioned with the analytical surface facing down in the mold, which is then filled to approximately 25% with molten paraffin. (C) Air bubble removal: Gentle pressing is applied to the tissue within the mold to remove any trapped air bubbles, ensuring optimal embedding quality. (D) Cassette placement and paraffin filling: The tissue cassette is placed on top of the mold, and the remaining space is filled completely with molten paraffin. (E) Cooling for solidification: The mold is transferred to a cooling plate or ice tray to allow the paraffin to solidify thoroughly. (F) Solidified paraffin block: The fully solidified paraffin block, containing the embedded tissue, is ready for subsequent sectioning and histological analysis.

실험에 사용하는 핀셋과 몰드는 항상 60°C 이상의 가온 챔버에서 보관하고, 조직을 몰드로 옮길 때는 가열된 핀셋을 사용해 파라핀의 조기 응고와 핀셋이 조직에 달라붙는 것을 방지한다. 조직은 분석 면이 몰드 하부를 향하도록 배치하고, 가열된 파라핀을 몰드의 약 25%만 채운 뒤 냉각판 위에서 여러 방향으로 눌러 내부 공기 방울을 제거한다([Fig. 8B-C]). 이 과정은 몰드 상부의 파라핀이 응고되기 전에 신속히 수행해야 한다. 이후 카세트를 몰드 상부에 올려 검지로 고정한 뒤, 나머지 공간을 파라핀으로 채우고, 포매 센터의 냉각 장치나 얼음 트레이에서 완전히 경화시킨다([Fig. 8D-F]; Howard et al., 2004).

박절 단계는 회전형 박절기(rotary microtome)([Fig. 9A])를 사용해 파라핀 블록을 4~6 µm 두께로 얇게 절단하는 과정이다(Cho et al., 2024). 적절히 처리된 조직이라도 박절 과정에서 미세 주름이나 말림 등 인공 산물이 발생하면 절편 품질이 저하된다. 이는 세포군의 중요한 형태학적 정보 손실 및 잘못된 해석으로 이어질 수 있으므로, 박절 단계는 조직학 연구에서 매우 중요하다(Kumar et al., 2012). 절편 제작 전 파라핀 블록은 냉장고에서 냉각하고, 절단 중에는 블록을 번호 순서대로 아이스배스(ice bath)에 보관한다.

[Fig. 9] 
Stepwise process for sectioning paraffin-embedded barnacle tissue blocks for histological analysis. (A) Rotary microtome: The rotary microtome is prepared for precise sectioning of paraffin-embedded tissue blocks. (B) Block alignment: The paraffin block is carefully aligned so that its surface is parallel to the microtome blade, ensuring even and smooth sectioning. (C) Smooth sections after warming: Thin tissue sections are produced, and gentle warming (such as by breathing on the block) is applied to achieve flat, wrinkle-free ribbons. (D) Sections on 70% ethanol: The freshly cut sections are transferred onto 70% ethanol for a few seconds, which helps relax and flatten the ribbons, minimizing folds or tears. (E) Fully spread sections on water bath: The sections are then floated on a 42°C water bath, allowing them to fully spread and flatten before being mounted onto glass slides for subsequent staining and analysis. (F) Drying on a slide warmer: The mounted sections are dried on a slide warmer to ensure adhesion and prepare them for staining.

Microtome blade는 박절기의 물림쇠에 균일하게 장착하고, 블록을 장착한 홀더는 칼날과 평행하게 밀착시킨다([Fig. 9B]; Howard et al., 2004). 핸들을 움직여 약 20 µm 두께로 절단해 표면의 불필요한 파라핀을 제거한 뒤, 목표 조직 부위가 노출되면 4~6 µm 두께로 박절한다. 절단 시 파라핀 블록 겉면에 고르게 입김을 불어 표면을 약간 따뜻하게 한 후 절삭하면 평탄한 절편을 얻을 수 있다([Fig. 9C]). 제작된 절편은 핀셋으로 50~70% 에탄올에 수 초간 담갔다가([Fig. 9D]), 42°C로 설정된 워터배스에 띄운다([Fig. 9E]). 고농도 에탄올에 절편을 먼저 담갔다가 항온수조에 띄우면 농도 및 표면장력 차이로 절편이 빠르고 효과적으로 펴진다(Kumar et al., 2012). 완전히 펼쳐진 절편은 슬라이드 글라스를 물에 넣었다가 천천히 들어 올려 중앙에 위치시키고, 42°C 오븐에서 약 12시간 건조한다([Fig. 9F]; Howard et al., 2004).

염색(staining)은 조직의 미세 구조를 시각적으로 강조하고, 세포 및 조직 간 미세한 차이를 명확히 구분할 수 있도록 하는 기술이다(Alturkistani et al., 2015). 다양한 염색법이 있으나, 가장 보편적으로 사용되는 방법은 헤마톡실린-에오신(H&E) 염색이다. 헤마톡실린과 에오신은 모두 수용성 염료로, 시료 적용 전 탈파라핀(deparaffinization), 탈자일렌(de-xylene), 재함수(rehydration) 과정이 필요하다(Cho et al., 2024). 헤마톡실린은 염기성 용액으로 핵산 등 산성 구조물을 선택적으로 염색해 핵을 청자색 또는 자주색으로 나타내고, 에오신은 산성 용액으로 세포질, 근원섬유 등 염기성 성분을 분홍-적색 계열로 염색한다. 본 연구에 사용된 염색 절차는 다음 표에 제시하였다(<Table 3>).

염색이 완료된 시료는 추가 탈수 및 투명화 과정을 거친 후, 마지막 단계인 봉입(mounting)을 수행한다. 염색된 조직 절편은 방치 시 건조되어 광학 현미경 관찰이 불가능하므로, 봉입제를 사용해 커버글라스로 밀봉하는 것이 필수적이다. 일반적으로 캐나다 발삼(Canada balsam) 또는 말린올(Malinol)이 주로 사용된다([Fig. 10A]; Cho et al., 2024). 자일렌(xylene) 용액에 보관된 슬라이드는 평평한 면에서 가볍게 흔들어 잔여 용액을 제거한 뒤, 봉입제를 1~2방울 떨어뜨린다([Fig. 10B-C]). 이후 조직 크기에 맞는 커버글라스를 덮고, 핀셋으로 내부 기포를 최대한 제거한다([Fig. 10D]). 봉입제가 완전히 경화될 때까지 24시간 이상 건조한 후, 광학 현미경으로 조직 절편을 관찰한다.

[Fig. 10] 
Stepwise procedure for mounting stained barnacle tissue sections for microscopic observation. (A) Mounting media: Canada balsam and Malinol are prepared as the mounting media for sealing stained tissue sections. (B) Slide preparation: The slide is gently shaken on a flat surface to remove any residual xylene solution, ensuring a clean surface for mounting. (C) Application of mounting medium: 1–2 drops of the chosen mounting medium are carefully applied onto the tissue section. (D) Coverglass placement: A coverglass is placed over the section, and air bubbles are removed using tweezers to ensure a clear and even seal.

번식 생리 연구에서는 단순한 육안적 외관뿐 아니라, 난소와 정소의 조직학적 구조를 면밀히 관찰하는 것이 중요하다. 일반 무척추동물과 마찬가지로, 따개비는 번식기에 맨틀강에 난소가 대부분을 차지하며, 난소소관(Ovariole) 내에는 난원세포, 미성숙 난모세포, 성숙 난모세포 등 다양한 발달 단계의 세포가 존재한다. 특히 성숙기에는 성숙 난모세포가 지배적으로 나타난다([Fig. 11F-G]). 정소에서는 소엽(follicle) 중심부에 밀집된 정자 집단이 뚜렷하게 관찰되며([Fig. 11D-E]), 이는 성숙한 수컷 개체의 주요 지표로 활용된다. 활발한 번식기에 해당하는 개체에서는 몸체 내 양쪽에 한 쌍으로 위치한 알과 함께, 방출 직전의 노플리우스 유생이 동반 관찰되기도 한다([Fig. 11B-C]). 이러한 조직학적 특징들은 번식 주기 단계와 개체의 생식 능력을 종합적으로 판단하는 데 중요한 근거가 된다.

[Fig. 11] 
Representative images illustrating the anatomy and histological features of barnacle tissues relevant to reproductive physiology studies. (A) Diagram of barnacle anatomy: Schematic depiction showing the spatial arrangement of key reproductive organs and egg mass structures within the barnacle body. (B) Egg mass: Microscopic image displaying an egg mass containing multiple eggs, highlighting the clustering and organization typical of barnacle reproduction. (C) Nauplius larva: Histological section of a nauplius larva, demonstrating characteristic features such as the caudal spine and mandible, which are diagnostic for larval identification. (D-E) Testis: Section of testicular tissue showing a distinct cluster of spermatozoa densely aggregated in the central region of the testicular lobule, indicative of active spermatogenesis. Red arrows indicate the tails of spermatozoa. (F-G) Ovary: Ovarian tissue containing both immature and mature oocytes; yellow arrows mark immature oocytes, while red arrows indicate mature oocytes, demonstrating the various stages of oocyte development within the same specimen. Scale bars = (B) 500 μm; (C, D, F) 100 μm; (E, G) 50 μm.