Current Issue

2016년도 5월부터 2017년도 9월까지 쿠도아 감염이 확인되었던 양식장 1개소를 선정하여 K. septempunctata에 대한 감염조사를 총 두 차례에 걸쳐 PCR 검사법과 현미경적 검사법을 사용하여 실시하였다. 선정된 넙치양식장에서 여과 혹은 살균처리를 하지 않은 일반적인 자연해수를 사육수로 사용하는 한 개 수조를 지정하여 매월 시료 채취일을 하루 정하여 30마리씩 랜덤으로 채취하여 체장과 체중을 측정하고, 개체 별로 근육조직을 몸통 전체에서 골고루 채취하여 골고루 섞이도록 으깨어 분석에 냉동(-20℃)보관하였다가 분석에 사용하였다. 조사 기간 동안 조사 대상어의 수조이동은 하지 않도록 하였다.

1차 조사는 2016년도는 봄에 치어가 입식되는 시기인 5월부터 다음해 2월까지 성어로 출하되기까지 매월 시료를 채취하는 것을 목표로 하였으나, 6월은 샘플링을 하지 못하였고, 8월과 9월은 샘플링을 겸하여 9월 초순에 실시하였다. 1차 조사 기간 동안 조사 수조의 평균체중과 체장의 변화는 [Fig. 1]에 나타내었다. 2차 조사는 2017년도 5월부터 그 해 9월까지 매월 말경에 1차 조사와 같은 방법으로 조사를 실시하였다.

[Fig. 1] 
Increase lines of body length (BL) and body weight (BW) in the 1^st survey

매월 30마리의 개체별 근육조직에 대한 PCR 검사와 현미경적 검사는 다음과 같이 실시하였다. PCR 검사방법은 개체별로 으깬 근육 0.25g을 1ml의 PBS에 곱게 마쇄하여 100μl를 DNA Mini kit(QIAGEN, USA)를 사용하여 근육조직으로부터 genomic DNA를 추출하고, 추출된 DNA를 주형으로 K. septempunctata 28S rDNA 가운데 356bp를 합성하는 PCR 검사법(Grabner et al., 2012)을 사용하였다. PCR 검사는 하나의 샘플에 대하여 2반복으로 실시하여 두 번 모두 양성 밴드가 확인된 샘플에 대하여 양성으로 판정하였다. 현미경적 검사법(Song et al, 2013)은 PCR 검사를 위해 마쇄한 근육 조직을 슬라이드글라스에 10μl 도말하여 자연건조 시킨 후 100% 에탄올로 고정하고 methylene blue로 염색, 세정, 건조 한 후 봉입제로 봉입하여 광학현미경으로 관찰하였으며, 슬라이드 한 장에 도말된 전체 염색면에서 포자가 한 개라도 관찰된 개체는 양성으로 하였다. 검출결과에 대한 경향분석은 포자검출율/PCR검출율과 PCR검출율/포자검출율을 환산하여 비율(ratio)로 나타내었다.

검사 대상은 PCR 검사에서 양성을 나타내면서 현미경적 검사로 포자가 관찰되지 않았던 개체(2017년도 8월과 9월에 각 3마리씩, 체장 22.4±1.0cm, 체중 122.7±16.9g)와 PCR 검사에서 양성을 나타내면서 현미경적 검사에서 포자가 다수 확인된 개체(2017년도 8월과 9월에 각 3마리씩, 체장 24.2±2.0cm, 체중 144.7±43.0g)를 구분하였으며, 이들 가운데 10% 중성포르말린에 고정된 근육조직을 선별하여 염색 슬라이드표본을 제작하기 위한 일련의 처리과정을 거쳐 근육조직에 대한 Hematoxylin and Eosin(H&E)염색을 실시하여 광학현미경으로 관찰하였다. 고정한 근육 조직에 대한 조직처리 과정은 다음과 같다. 조직 표본 제작을 위해 세절(약 8×2 mm 전후)하여 10% 중성포르말린에 2차 고정하고 18∼24 h 이내에 수세(3∼5h)한 후 단계별 알콜(60~100%)에 탈수하고, xylene에 투명화 과정을 거친 후 파라핀 침투시켜 파라핀 조직블럭을 제작한다. 마이크로톰(RM2035, Leica)으로 4㎛ 두께의 조직절편을 잘라 슬라이드글라스에 부착하고 건조시킨 후(45~50℃), H&E염색을 실시하여, 봉입한 후 광학현미경(Axio ImagerA1, ZEISS)으로 관찰하면서 영상촬영 시스템(Zen2012, ZEISS)으로 이미지를 캡쳐하였다.

ISH를 위한 Dig labeling probe의 합성에는 본 연구실에서 디자인한 K. septempunctata의 5.8S~ITS2(GeneBank accession No. LC028894)의 일부분인 185bp에 대한 프라이머 set (Left 3’-AGCGCCTAGTGAGTCATTGA-5‘, Right 3’-ATCCAACACAACTGCCGAAC-5’)을 사용하였다. K. septempunctata 양성 genomic DNA를 주형으로 Ex Taq polymerase-HS(Hot start Version) 와 2.5 mM dNTP mixture set(TAKARA)를 사용하여 annealing 온도 59℃로 하여 1차 PCR을 실시하고, 여기서 얻어진 생성물을 주형으로 다시 같은 polymerase와 Dig labeling mixPLUS(Roche)를 사용하여 2차 PCR을 실시하여 Dig labeling PCR product를 제작하였다. 조직절편은 상법에 따라 포르말린 고정된 근육조직으로 파라핀 절편을 제작하여 알려진 방법(Lee et al., 2009, Do et al., 2013) 에 따라 Hybridization을 실시한 후, BCIP/NBT로 발색시켜 glycerol로 봉입하여 즉시 관찰하거나, Bismark brown Y 로 분별염색하여 봉입제로 봉입하여 건조, 보관하였다가 광학현미경(Axio ImagerA1, ZEISS) 으로 관찰하면서 영상촬영 시스템(Zen2012, ZEISS)으로 이미지를 캡쳐하였다.

2016년 5월부터 2017년 9월까지 K. septempunctata 의 감염 조사를 2회에 걸쳐 실시한 결과, 1차 조사였던 2016년 5월부터 2017년 2월까지의 PCR 검사 결과에서는 K. septempunctata 는 조사가 시작된 5월부터 검출되어 9월까지 지속적으로 증가하며 검출되었다. 10월 이후로는 감소하였으며 겨울철로 들어서는 12월부터는 급격히 감소하여 다음해 2월까지 유사한 정도를 유지하면서 검출되었다. 현미경적 검사의 경우에는 7월까지 검사에서는 포자가 관찰되지 않았지만 9월에 검출이 시작되어 10월에 조금 증가하였다가 이후로 낮아지면서 2월까지 지속적으로 검출되는 것을 확인할 수 있었다(data not shown). [Fig. 2]에서 나타나는 것과 같이 포자검출에 비해서 PCR검출이 월등히 높은 때는 9월초였으며, 포자검출은 9월초부터 나타나지만 10월이 가장 높았다. 그러나 PCR검출도 함께 낮아져서 포자검출율과 PCR검출율의 상대적인 비율은 10월 이후로 유사하게 나타났다. 포자검출은 9월부터 다음해 2월까지 지속적으로 나타났지만 PCR 검사의 양성개체보다 현미경적 검사에서 양성 개체가 수적으로 적어 포자 검출의 상대적 비율이 PCR 검출의 상대적 비율보다 낮은 것을 그림으로 알 수 있다([Fig. 2]).

[Fig. 2] 
The ratios of Spore detection rate/PCR detection rate and PCR detection rate/Spore detection rate.

1차 검사에서 K. septempunctata에 대한 PCR 검출은 5월부터 시작되어 가장 높게 나타난 시기는 7월이었으며, 포자는 7월까지는 검출되지 않았고 9월 초에 검출되기 시작하였다(data not shown). 2차 검사에서는 PCR 검출이 7월부터 나타나기 시작하여 8월이 가장 높았으며, 포자는 8월부터 관찰되기 시작하여 검사가 종료되는 9월에 높게 나타났다(data not shown). K. septempunctata에 대한 PCR 검사와 현미경적 검사를 통하여 유전자와 포자가 검출되기 시작하는 시기는 1∼2개월의 기간 차이를 두고 나타나는데, 이러한 동향은 2016년도와 2017년도 유사하게 나타나는 것으로 확인되었다([Fig. 3]).

[Fig. 3] 
The ratio of Spore detection rate/PCR detection rate and PCR detection rate/Spore detection rate. The results from Summer to Autumn in 2016 and 2017.

PCR 검사에서 양성 밴드가 확인된 개체의 근육 조직의 경우, 현미경적 검사에서 포자관찰의 여부와 상관없이 한 개의 근육 다발에 국한된 근육괴사가 정도의 차이를 보이며 관찰된다([Fig. 4A]). PCR 검사와 현미경적 검사에서 모두 양성인 근육 조직의 경우, 근육 괴사와 pseudocyst 형성이 관찰되며 같은 근육 다발 내에서 포자 형성과 근육 괴사가 같이 관찰되기도 한다([Fig. 4B]). 이들 중 포자수가 많은 감염체의 경우, plasmodial wall에 둘러싸인 포자의 pseudocyst가 형성되어 주위의 정상적인 근육 조직과 완벽하게 구분되어 뚜렷한 pseudocyst가 관찰된다([Fig. 4C]). PCR 검사에서 양성이지만 포자가 관찰되지 않는 근육조직의 일부는 근육조직 사이의 혈관주위에서 대식세포(macrophages)의 집합체가 관찰되기도 한다([Fig. 4D]).

[Fig. 4] 
A: Myoliquafaction in a bundle of muscle tissue, B: Early stage of pseudocyst(arrow) and myoliquafaction(circle) in a bundle of muscle tissue, C: Psudocyst in a bundle of muscle tissue, D: Mass of macrophages(circle) around vessel in muscle tissue.

PCR 검사에서만 양성을 나타낸 근육 조직에 대하여 ISH를 실시하여 관찰한 결과, H&E염색에서 근육 괴사를 나타내는 근육다발([Fig. 5A]) 내에는 옅은 ISH양성반응의 세포들이 다양한 형태로 관찰되는 것을 알 수 있었다([Fig. 5B]). PCR 검사에서 약한 양성을 나타내는 근육 조직의 경우에도 ISH를 실시하여 양성반응을 나타내는 다양한 형태의 세포들을 관찰할 수 있었는데, 세포 내에 핵 파편처럼 염색되어 관찰되는 5㎛ 보다 작은 크기의 세포(pseudoplasmodia) ([Fig. 5C]), 세포 내 공포와 같은 핵을 가지는 무정형의 세포(monosporic pseudoplasmodia) ([Fig. 5D]), 작은 핵을 가지는 무정형의 세포(plasmodia)([Fig. 5E]), 그리고 타원형의 큰 공포와 같은 핵을 가지는 형태(monosporic plasmodia)([Fig. 5F]) 등의 다양한 형태의 세포가 관찰되었다.

[Fig. 5] 
A: Necrotized muscle bundle (circle), H&E stain. B: Necrotized muscle bundle reacted ISH (Counter stained with Bismark Brown Y), arrows are ISH positive cells, C~F: ISH positive cells in muscle tissue.

PCR 검사에서 양성 밴드가 뚜렷하게 관찰되었으나 현미경적 검사에서 포자가 관찰되지 않았던 근육 조직의 경우, 마쇄한 조직을 슬라이드에 도말하여 methylene blue 염색하였을 때, 직경 10㎛ 보다 작은 구형 내지는 무정형의 작은 세포([Fig. 6A])와 15㎛정도의 비교적 큰 세포가 관찰되었으며, 큰 세포의 경우, 세포질 내부에 구형의 내재 세포가 다수 존재하는 경우도 있었다([Fig. 6B]).

[Fig. 6] 
Smear samples of minced muscle that revealed the positive response only at PCR method(Methylene blue staining). A: Small size plasmodium(arrows), B: Large size plasmodium(arrows).