넙치(Paralichthys olivaceus)의 Streptococcus parauberis 감염에 아목시실린과 비타민C 복합제가 미치는 영향
Abstract
We determined the effects of amoxicillin and vitamin C complex (Amox-vitamin C) on olive flounder, Paralichthys olivaceus infected by Streptococcus parauberis. The minimum inhibitory concentration (MIC) value of Amox-vitamin C and amoxicillin regarding 15 strains of S. parauberis were lower than 1.56 μg/mL. Olive flounder were orally administered Amox-vitamin C (240 mg/kg) (Amox-vitamin C group) or amoxicillin (240 mg/kg) (Amox group) for 5 days after intraperitoneal injection with S. parauberis (1⨯105 CFU/fish). The cumulative mortalities of Amox-vitamin C group and Amox group for the one month period were 16% and 20%, respectively. The cumulative mortality of olive flounder intraperitoneally injected with S. parauberis as the positive control was 100%. There was no mortality even after 30 days observation in negative control group.
Keywords:
Amoxicillin, Vitamin C, Streptococcus parauberisⅠ. 서 론
양식어류의 연쇄구균병은 넙치를 포함하여 방어, 조피볼락, 무지개송어 등 다양한 어종에서 발병하며, Lactococcus garvieae, L. piscicum, Streptococcus iniae, S. difficilis, S. parauberis등이 주요 원인체로 알려져 있다(Kusuda and Salati, 1993; Austin and Austin 1999).
최근 국내에서는 S. parauberis가 다양한 지역의 양식 넙치로부터 높은 비율로 검출되고 있으며(Cho et al., 2008), 감염된 넙치는 체색흑화, 피부궤양, 지느러미출혈, 안구돌출과 출혈, 안구백탁 및 탈장 등의 외부증상을 나타낸다(Kang et al., 2007). 항생물질은 사람이나 동물의 질병 발생을 예방하거나 치료를 목적으로 사용되어 왔으며, 일반적으로 어류 세균성 질병에 대한 대처 방법으로 항생제가 사용되고 있다(Tollefson et al., 1997; Gaskins et al., 2002).
아목시실린(amoxicillin; Amox)은 페니실린계열 반합성 항생물질로 그람양성과 그람음성 세균 등에 작용하는 광범위한 항생제로 세균의 세포벽 합성에 관여하는 transcarboxylpeptidase와 transpep- tidase에 작용하여 세균의 세포벽 합성을 억제함으로써 항균력을 갖게 된다(Brown and Grant. 1992, 1993; Inglis et al., 1992, 1993). 주로 양식어류에 발생하는 유결절증, 비브리오병, 연쇄상구균병 및 에드워드병에 치료제로 사용되고 있다(Lambert and O’Grady, 1992).
비타민 C (Vitamin C)는 콜라켄 형성에 필수적인 영양소로 알려져 있으며, 콜라겐 형성에 중요한 hydroxyl proline과 hydroxylysine 생성을 위한 보조인자로 작용한다(Sandel and Daniel, 1988). 양어사료 내 비타민 C 첨가는 어류의 성장, 면역활성, 질병저항성 및 내성을 향상시키는 것으로 보고되었으며(Eo and Lee, 2008; Zhou et al., 2012), 비타민 C를 안전하게 사용하면 항생제를 적게 사용함으로써 항생제에 대한 부작용을 줄일 수 있다(Farber and Ross, 1950).
본 연구에서는 넙치의 주요 세균성 질병인 S. parauberis 균주에 대한 Amox-vitamin C 복합제의 항균활성을 관찰하기 위해 MIC 시험을 실시하였고, S. parauberis균주에 감염된 넙치에 대한 임상효과 및 안전성을 조사함으로써 어류질병 치료 약제로서의 가능성을 확인하고자 하였다.
Ⅱ. 재료 및 방법
1. 실험어
실험어는 제주도내 양식장에서 어류질병에 대한 감염 이력이 없는 넙치를 구입하여, 제주대학교 해양과학연구소로 운송시켜 1주일 간 시판 배합사료를 공급하면서 실험환경에 적응할 수 있도록 순치하였다. 넙치(평균체장 및 무게: 11.8±0.35cm, 11.9±0.42g)는 총 6개의 110 L 원형플라스틱 수조에 각 수조당 30마리씩 나누어 주었다. 광주기는 형광등을 이용하여 12L:12D 조건으로 유지되었고, 실험기간 동안의 사육 수온은 25±1℃를 유지시켰다.
2. 시험의약품의 투여 및 성장률
Amox-vitamin C 복합제는 동물용의약품으로 시판되고 있는 Komipharm사 (본 제제: 1kg 중 Amox 100g (역가), Vitamin C 10,000mg (역가); 용법: 어체중 1톤당 최소200g~최대800g)의 수산용 혼합 분제를 구입하여, Jung et al., (2008)의 방법에 따라서 시판되는 배합사료에 Amox-vitamin C를 940 mg/kg (최대 권장량)이 되도록 조제하여 5일간 경구투여 한 후(1일 1회, 만복공급), 30일간 대조구와 동일한 배합사료를 제공하여 5일 간격으로 어체 증체량 및 안전성을 조사하였다.
통계분석은 SPSS (Ver 21) 통계분석 프로그램을 활용하여 t-test로 분석하였으며, p<0.05에서 유의성을 판단하였다.
3. 사용 균주
본 실험에 사용된 S. parauberis 균주는 제주의 넙치 양식장들로부터 분리한 총 15개의 분리주이며(<Table 1>), 분리된 균주는 colony의 형태적 특성, Gram-stain 및 Streptococcus sp.의 선택배지의 증식여부를 확인 후, PCR법을 이용하여 S. parauberis 균주임을 확인하였다.
Streptococcus parauberis strains used in this study
4. 최소억제농도 측정
Amox-vitamin C의 항균활성을 관찰하기 위해서 vitamin C가 포함되지 않은 수산용 분제 Amox group (본 제제: Amox 100g (역가), Komipharm)을 추가적으로 설정하여 차이점을 관찰하였고, 각각의 농도는 0.98 ∼ 500 μg/mL로 96-well plate와 Muller-Hinton Broth 배지(Difco Co., USA)를 이용한 표준 2배 희석 방법으로 측정하였다(Lee et al., 2003). 25℃에서 18시간 배양한 후 세균의 증식에 따른 액체 배지의 혼탁도를 관찰하여 세균이 자라지 않는 항생제의 최저 농도를 MIC값으로 결정하였다.
5. 임상실험
총 4개의 실험구 중 3개에는 S. parauberis (1X106 CFU/mL)를 0.1mL씩 복강 주사한 후, 다음날에 2개의 실험구에는 수산용 분제 Amox를 240mg (최소권장량)과 수산용 혼합분제 amox-vitamin C (240mg)를 각각 5일간 경구투여 한 후, 30일간 일반 배합사료를 공급하였다(Amox group, Amox-vitamin C group). 또한, 양성대조구로서 S. parauberis를 접종하였고, 음성대조구로서 PBS를 접종한 후(<Table 2>), 30일간 일반 배합사료를 공급하였다. 모든 그룹은 1일 1회 만복 공급하였고, 수온은 25℃를 유지하였으며, 30일간 폐사를 관찰하였다.
Challenge experiments were performed by injecting olive flounder, Paralichthys olivaceus intraperitoneally with 0.1mL of Streptococcus parauberis (1X106 CFU/mL).
Ⅲ. 결과 및 고찰
본 연구에서는 Amox-vitamin C 복합체가 넙치의 세균성 감염에 미치는 영향과 대상생물에 대한 안전성을 확인하기 위하여 S. parauberis 균주를 대상으로 최소억제농도 시험을 실시하였고, 넙치의 안전성 및 임상실험을 수행하였다.
Amox-vitamin C를 940mg 첨가하여 5일간 경구 투여한 후 30일간 대조구와 동일한 배합사료를 제공하여 5일 간격으로 어체중 변화를 조사한 결과, 투여 25일 이후 amox-vitamin C group이 대조구보다 유의적으로 증가하였고(<Table 3>), 실험기간 동안 대조구와 amox-vitamin C groups에서 특이한 증상 및 폐사는 관찰되지 않았다(data not shown).
Growth performance of olive flounder, Paralichthys olivaceus fed the experimental diets for 5 days, with checks every 5 days. The experiments were accomplished for 30 days.
Amox-vitamin C의 효능을 조사하고자, vitamin C가 포함되지 않은 amox group을 추가하여 최소억제농도를 측정한 결과, amox-vitamin C group에 대한 최소억제농도 값이 amox group보다 효과가 우수한 것으로 나타났다(<Table 4>).
Minimum inhibitory concentration (MIC) value of Amox-vitamin C and Amox regarding 15 strains of Streptococcus parauberis
그러나, 두 그룹 모두 S. parauberis 15균주에 대한 최소억제농도의 값이 1.56 μg/mL 이하로 CLSI의 민감수준(MIC ≤ 2 μg/mL)에 유효한 항균제임이 확인되었고, 이는 페니실린 항생제 중 세균에 대한 항균효과가 우수한 amox와 항생물질의 효과를 증가시키고 보조적인 역할을 하는 vitamin C의 결합으로 인해 단독으로 사용한 amox보다 효과가 우수한 것으로 사료된다.
본 연구에서 사용된 amox-vitamin C의 항균력을 조사하고자 총 4개의 실험구로 나눠 S. parauberis에 감염된 넙치에 각각의 항생제(240mg)를 조제하여 5일간 경구 투여 후 30일간 폐사율을 관찰한 결과, Amox group과 Amox-vitamin C group에서는 각각 20%, 16%의 누적 폐사율이 관찰되었다([Fig. 1]). 또한, 양성대조구에서는 10일째부터 폐사를 보이기 시작하여 23일째에 100% 누적 폐사하였고, 음성대조구에서는 실험 기간 동안 폐사가 발생하지 않았다([Fig. 1]). Amox-vitamin C는 권장되는 최소 농도에서도 S. parauberis 치료에 효과가 있다는 것을 나타내었으며, 양식현장에서는 시험의약품 기준을 준수하여 적절하게 사용되어야 할 것이다.
![[Fig. 1]](/xml/16430/KSFME_2018_v30n5_1769_f001.jpg "[Fig. 1]")
Cumulative mortality of olive flounder, Paralichthys olivaceus intraperitoneally infected with S. parauberis.
본 연구에서는 amox-vitamin C 복합제를 사용하였을 때 넙치에 발병하는 S. parauberis 균주에 대한 효능을 조사하였으며, amox-vitamin C 복합제가 세균에 대하여 강력한 항균력을 나타낸다는 것을 확인하였고, 향후에는 이러한 복합제에 대한 내성균의 출현을 사전 방지하고 유효성 검증을 위해 어류 내 항생제 잔류량 검사가 필요할 것으로 여겨진다.
Acknowledgments
이 논문은 2018학년도 제주대학교 교원성과지원사업에 의하여 연구되었음.
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