포르말린 폭로에 따른 스쿠티카충의 유전체 발현 특성

Ⅰ. 서 론

전 세계적으로 수산양식 산업의 급속한 성장으로 인한 수산생물의 생산량 증가와 더불어 양식생물의 질병발생이 증가함에 따라 양식현장에서 수산용의약품의 사용빈도가 증가하고 있는 실정이다. 수산용의약품의 사용은 수산생물의 질병을 예방·치료 및 안전한 수산식품의 생산에 있어 매우 중요한 영향을 미치고 있다. 국내 수산용의약품 판매시장은 300 억원대 시장으로 동물용의약품 8,000 천원의 대략 4% 이내로 매우 작은 시장이며, 판매의약품이 항생·항균제, 수산용백신 및 대사소화기계 의약품이 많은 판매범위를 차지하고 있다.

국내외 양식어류에 발생하는 기생충성 질병을 치료하기 위해 수산용 포르말린이 일반적으로 수십년 동안 구충제로 사용되어 왔다. 국내의 수산용 포르말린은 2006년도에 국립수의과학검역원(현 농림축산검역본부)으로부터 품목허가 받아 현재는 11개사 11개 제품이 판매되고 있으며 넙치에서 발생하는 외부기생성 원충류(Ichthyobodo sp., Scuticociliatida)에 대하여 100~200 ppm, 1시간 약욕 및 무지개 송어와 연어의 난에 감염하는 수생균(Sprolegnia spp.)에 1,000~2,000 ppm, 15분 약욕의 용법·용량으로 사용하도록 허가되어 있다(NIFS 2016).

국외에서는 수산용 포르말린이 미국, 호주, 캐나다 등에서 수산용의약품으로 품목허가 되어, 양식장의 외부 기생충 및 곰팡이성 질병에 대한 치료약제로 사용되어 왔다(Schnick, 1991; Rach et al., 1997).

국내외에서 수산용 포르말린의 어류 기생충 구제 효능효과 등을 연구한 다양한 논문이 보고되고 있다. 넙치 스쿠티카충(Jung et al., 2001), 감성돔(Myeong et al., 2013), 뱀장어(Jung et al., 2010), 농어 및 복섬에 감염된 갈리구스충 (Caligus sp.), 넙치 트리코디나충(Trichodina sp.) 및 yellowtail kingfish 베네데네아충(Benedenea seriolae)에 대해서도 구제 효과를 보고하였다. (Dayanadol & Grajaaywong, 1996; Sharp et al., 2004; Seo et al., 2010). 또한, 뱀장어 아가미흡충 (Mellergaard & Dalsgaard, 1987) 및 새우 Peritrichous ciliates(Bell et al., 1987) 구제를 위한 효능효과를 측정하였고 대부분 사용용량은 최대 200 ppm 이하로 보고되었다. 수산용 포르말린은 수온, 빛, 용존 산소 등 수계 환경 요인에 의하여 기생충 구제의 효능효과에 많은 영향을 받는 것으로 알려져 있다(Myeong et al., 2013; Woo et al., 2018; Jung et al., 2001). 국내 양식 넙치는 고밀도 육상 수조식 양식으로 치어 양식에 있어 스쿠티카충 질병이 만연 하다고 알려져 있어 구제제로서 수산용 포르말린 제품이 많이 사용되고 있다. 그러나, 일부 양식 어가에서는 양식 사육 환경개선보다 수산용 포르말린의 지속적 사용에 따른 스쿠티카충 내성이 발생되어 수산용 포르말린 효능이 감소되므로 양식현장에서는 실제 수산용 포르말린 용량을 늘려 사용하고 있는 실정이다.

따라서, 본 연구에서는 국내 주요 양식어류인 넙치 기생충성 질병인 스쿠티카충이 수산용 포르말린 폭로(exposure)에 따른 분자생물학적 대사체계의 변화를 유전체(transcriptome)로 측정하여 스쿠티카충의 수산용 포르말린에 대한 영향을 분자생물학적으로 알아보고자 하였다.

Ⅱ. 재료 및 방법

Ⅲ. 결과 및 고찰

1. 스쿠티카충의 RNA 순도

CHS-214에서 순수 배양되어진 스쿠티카충 및 수산용 포르말린을 96시간 폭로(exposure)시켜 배양한 스쿠티카충을 원심분리하여 RNA를 분리하였다. 분리한 스쿠티카충의 RNA 순도는 [Fig. 1]에서 보는 바와 같이 매우 순도가 높게 나타났다.

[Fig. 1]

RNA identification of scuticociliate, Miaminesis avidus. 1; parasite in 0 ppm formalin exposure (Control), 2; parasite in 10~50 ppm formalin exposure for 96 hour.

2. 스쿠티카충의 유전체 분석

수산용 포르말린은 양식장 내에서 발생하는 외부 기생충 및 수생균을 구제하는 화학물질로 미국, 캐나다, 한국 등에서 허용되어 사용되고 있는 수산용의약품이다(Voorhees and Barnes, 2016).

수산용 포르말린의 투여에 따른 어류 내성 영향은 여러 논문에서 발표되었으나, 외부기생충 구제로서 사용 시 기생충의 생화학적 영향에 대한 연구는 전무한 편이다. 수산용 포르말린은 다양한 외부환경 중 수온 등에 의하여 약품의 활성에 영향을 많이 받는다고 알려져 있다(Woo et al., 2018). 본 연구에서 차세대염기서열기(GX Flex)를 이용하여 대조구 및 수산용 포르말린 처리 스쿠티카충으로부터 187,210 및 177,959 contig 유전체를 각각 얻었다. 얻어진 샘플의 스쿠티카충 RNA level 내 각 대사체계 process상의 단백질 발현 패턴을 분석하기 위하여 Blast2GO를 이용한 gene ontology를 수행하였다([Fig. 2]).

[Fig. 2]

Gene Ontology(GO) annotation associated with the transcriptome of M. avidus.

Biological process 결과에 따르면, 전체적인 단백질의 구성성분 패턴은 변화가 없으나, primary metabolic process에 관여된 유전자들이 수산용 포르말린 처리에 따라 증가하며, 대체적으로 세포 내 대사에 관여된 유전자 수의 발현이 증가함을 알 수 있었다. 마찬가지로 세포 내 구성성분(Cellular component)의 변화를 조사하였을 때에도 수산용 포르말린 처리에 따라 세포 내 성분 유전자가 대조구에 비해 전체적으로 증가함을 알 수 있었다. 마지막으로 분자 기능(molecular function)의 변화를 조사하였을시에도 두 그룹간에는 전체적인 패턴 변화가 없으나 수산용 포르말린 처리에 따라 관련 유전자들이 증가됨을 알 수 있었다. 현재까지 스쿠티카충 transcriptome의 GO 분석을 수행한 연구는 없으나 어류 병원체이면서 섬모충인 백점충의 GO 분석을 통한 Biological process, cellular process 등의 자료를 비교하였을 시에 섬모충 간 유사한 형태를 가짐을 알 수 있었다(Cassidy-Hanley et al., 2011).

본 논문은 스쿠티카충을 10회 계대 배양동안 지속적으로 수산용 포르말린에 폭로(exposure) 후 스쿠티카충 RNA 유전자의 transcriptome을 분석하였다. RNA transcriptome 분석을 위해 대조구 및 수산용 포르말린 폭로 그룹의 RNA 유전자는 house keeping 유전자인 β-actin 유전자 발현량으로 normalization 시켰다.

<Table 1>에서 보는 바와 같이 NCBI blast를 수행하였을시에 대조구에 비해 3배 이상 증가하는 상위 10개의 유전자는 모두 섬모충의 유전자 정보로 나타나나, 대부분 유전적 기능이 알려져 있지 않은 것으로 나타났다. 그러나, 수산용 포르말린 처리 시 up-regulation되는 유전자 중 von Willebrand factor type A는 말라리아의 숙주 감염에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다(Pihlajamaa et al., 2013).

<Table 1>

Genes showing differential transcription expression between control/formalin treated group

스쿠티카충의 RNA transcriptome의 down level을 분석하면 cathepsin L-like cysteine protease, Leishmanolysin family protein 유전자가 영향을 많이 받음을 알 수 있었다<Table 1>. 스쿠티카충의 cathepsin L like cysteine protease 및 Leishmanolysin family protein은 이전 논문에서 기생충의 외부 병원체 침입에 대한 방어에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다(Ahn et al., 2007; Seo et al., 2013). 수산용 포르말린의 장기간 폭로(exposure)는 스쿠티카충의 대사체계 중 방어 관련 단백질의 감소에 영향을 미치는 것으로 사료된다.

포르말린 처리에 따른 스쿠티카충 RNA 유전자들을 조사하였을시에 기생충 내성에 관여할 것으로 보아지는 유전자는 나타나지 않으며, 대부분 기생충의 생체 대사와 관련된 단백질의 발현에 영향을 받는 것으로 나타났다. 향후, 스쿠티카충에 대하여 수산용 포르말린 처리 농도 및 시간에 따라 Real-time RT-PCR을 이용하여 본 연구에서 추정된 개별 유전자의 변화 추이를 더 조사할 필요가 있다.

본 연구결과들을 종합하여 보면, 수산용 포르말린의 장기간 폭로(exposure)로 인하여 특이적으로 움직이는 유전자 그룹을 알 수 있으나, 스쿠티카충의 내성을 유발시키는 특별한 유전 인자는 나타나지 않았다. 이러한 결과는 수산용 포르말린의 폭로(exposure)가 스쿠티카충의 내성에는 관여하지 않는 것으로 보아지며(Woo et al., 2018), 수산용 포르말린의 사용 시 넙치의 구충 효능효과가 떨어지는 것은 수온 등 외부 환경변화에 영향을 많이 받는 것으로 추정된다.

Acknowledgments

이 논문은 2018년 국립수산과학원 수산생물 방역프로그램 개발·운영 지원에 의해 수행되었음.

References

• Ahn, SJ, Seo, JS, Kim, MS, Jeon, SJ, Kim, NY, Jang, JH, Kim, KH, Hong, YK, Chung, JK, and Lee, HH, (2007), Cloning, site-directed mutagenesis and expression of cathepsin L-like cysteine protease from Uronema marinum (Ciliophora: Scuticociliatida), Mol Biochem Parasitol, 156(2), p191-198. [https://doi.org/10.1016/j.molbiopara.2007.07.021]
• Bell, TA, Arume, CS, and Lightner, DV, (1987), Efficacy of formalin in reducing the levels of peritrichous ciliates on cultured marine shrimp, Journal of Fish Diseases, 10(1), p45-51. [https://doi.org/10.1111/j.1365-2761.1987.tb00717.x]
• Cassidy-Hanley, DM, Cordonnier-Pratt, MM, Pratt, LH, Devine, C, Hossain, MM, Dickerson, HW, and Clark, TG, (2011), Transcriptional profiling of stage specific gene expression in the parasitic ciliate Ichthyophthirius multifiliis, Mol Biochem Parasitol, 178, p29-39. [https://doi.org/10.1016/j.molbiopara.2011.04.004]
• Dayanadol, Yaowanit, and Grajaaywong, W, (1996), Effects of some chemotherapeutic agents, hypersaline and freshwater on Caligus sp. infection in seabass (Lates calcarifer), Warasan Kan Pramong.
• Jung, SH, Jee, BY, Kim, JD, Seo, JS, and Kim, JW, (2010), Efficacy of formalin bath against gill infections with Pseudodactylogyrus spp. in cultured eel Anguilla japonica, Journal of Fish Pathology, 23(3), p293-302.
• Jung, SH, Kim, JW, Jeon, IG, and Lee, YH, (2001), Formaldehyde residues in formalin-treated olive flounder (Paralichthys olivaceus), black rockfish (Sebastes schlegeli), and seawater, Aquaculture, 194(3), p253-262. [https://doi.org/10.1016/s0044-8486(00)00530-5]
• Gotz, S, Garcia-Gomez, JM, Terol, J, Williams, TD, Nagaraj, SH, Nueda, MJ, Robles, M, Talón, M, Dopazo, J, and Conesa, A, (2008), High-throughput functional annotation and data mining with the Blast2GO suite, Nucleic Acids Res, 36, p3420-3435. [https://doi.org/10.1093/nar/gkn176]
• Mellergaard, S, and Dalsgaard, I, (1987), Disease problems in Danish eel farms, Aquaculture, 67(1-2), p139-146. [https://doi.org/10.1016/0044-8486(87)90019-6]
• Myeong, JI, Min, BH, Park, MS, Hwang, HK, Do, JW, Jeoung, KI, Chang, YJ, and Jeong, DS, (2013), Tolerance and Histological Responses to Formalin of Black Seabream Acanthopagrus schlegelii Juveniles, Korean Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 46(6), p923-929. [https://doi.org/10.5657/kfas.2013.0923]
• NIFS(National Institute of Fisheries Science), (2016), Explanation of the manual about products of fish drug, p27-40, Aquatic Disease Control Division.
• Pihlajamaa, T, Kajander, T, Knuuti, J, Horkka, K, Sharma, A, and Permi, P, (2013), Structure of Plasmodium falciparum TRAP (thrombospondin-related anonymous protein) A domain highlights distinct features in apicompexan von Villebrand factor A homologues, Biochem J, 450(3), p469-476. [https://doi.org/10.1042/bj20121058]
• Schnick, RA, (1991), Chemicals for worldwide aquaculture, In: ADB/NACA (Eds.), Report on a Regional Study and Workshop on Fish Disease and Fish Health Management ADB Agriculture Department Report Series No. 1. Network of Aquaculture Centres in Asia-Pacific, Bangkok, Thailand, p441-467.
• Seo, JW, Kim, WS, Han, KH, Lee, SH, Yoo, DJ, Kim, YC, and Oh, MJ, (2010), Parasitism of Pseudocaligus sp. in wild grass puffer Takifugu niphobles, and their treatment, Journal of Fish Pathology, 23(1), p107-112.
• Seo, JS, Jeon, EJ, Jung, SH, Park, MA, Kim, JW, Kim, KH, Woo, SH, and Lee, EH, (2013), Molecular cloning and expression of analysis of peptidase genes in the fish-pathogenic scuticociliate Miaminesis avidus, BMC Vet Res, 9(10). [https://doi.org/10.1186/1746-6148-9-10]
• Song, H, Yu, ZL, Sun, L, Gao, Y, Zhnag, T, and Wang, H, (2016), De novo transcriptome sequencing and analysis of Rapana venosa from six different developmental stages using Hi-seq 2500, Comparative Biochemistry and Physiology D, 17, p48-57. [https://doi.org/10.1016/j.cbd.2016.01.006]
• Sharp, NJ, Diggles, BK, Poortenaar, CW, and Willis, TJ, (2004), Efficacy of Aqui-S, formalin and praziquantel against the monogeneans, Benedenia seriolae and Zeuxapta seriolae, infecting yellowtail kingfish Seriola lalandi lalandi in New Zealand, Aquaculture, 236(1), p67-83. [https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2004.02.005]
• Voorhees, JM, and Barnes, ME, (2016), Airborne Formaldehyde Levels During Simulated Formalin Egg Treatments in Vertical-Flow Tray Incubators at a Production Fish Hatchery, Journal of Agricultural Safety and Health, 22(3), p199-207. [https://doi.org/10.13031/jash.22.11791]
• Woo, SJ, Lee, SH, and Chung, JK, (2018), Determination of formalin residue in muscle and observation of histopathological changes in freshwater and marine fish treated with formalin bath, JFMSE, 30(1), p28-37. [https://doi.org/10.13000/jfmse.2018.02.30.1.28]