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E.burgeri cathetpsin B 유전자의 전체 길이를 식별하기 위해, 어류 cathpsin B에서 높게 보존된 부위에서 설계된 Oligonucleotides를 디자인하였다. 총 RNA는 하이브리드-R Kit (GeneAll)를 사용하여 먹장어로부터 분리하였다. cDNA는 Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche)와 SuperScript^TM RT (Invitrogen)를 사용하여 분리된 mRNA에서 합성되었다. 

SMART RACE cDNA amplification kit (Clontech)를 사용하여 cDNA 혼합물과 5‘-RACE 및 3’-RACE 프라이머인 먹장어 특이적인 프라이머와 Universal 프라이머를 이용하여 5‘-RACE와 3’-RACE cDNA를 제작하였다. 본 연구에 사용된 프라이머 서열은 <Table 1>에 수록하였다.

증폭된 RACE 산물은 pGEM T-Easy 벡터(Promega)에 삽입하여 재조합체를 만들고, 이를 E.coli DH5α 수용 세포에 형질전환시켰다.

형질전환된 E.Coli는 100g/ml of ampicillin, 40g/ml 5-bromo-4-chloro-3-indoly—D-galactoranoside (X-Gal) 와 0.4 mM isopropyl-thiogalactopyranoside (IPTG)가 첨가된 Luria-Bertani 평판배지에서 배양하여, 무작위로 배양된 흰 군락을 골라 PureHelix Fast-n-Pure Plasmid Kit (NANOHELIX)를 사용하여 플라스미드 DNA를 추출하였다.

재조합된 염기서열은 M13(-20)F/M13(-20)R 프라이머를 이용하여 COSMO co, Ltd. (Seoul, Korea)에서 서열분석을 하였다. 밝혀진 염기서열은 GeneBankDatabase (http:www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)을 통하여 유사성을 조사하였다.

EbCtB 아미노산 서열의 유사성 분석은 BioEdit (Hall Tom A., 1999), 시그널 펩타이드는 SignalP 4.0 server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)를 이용하여 분석하였다. GENETYX Version 7.0.3 (Genetyx Co., Tokyo, Japan)을 이용하여 아미노산 서열의 다중 정렬을 분석하고, MEGA 6의 neighbor-joining법을 이용하여 계통수를 그렸다 (Tamura Koichiro et al., 2013).

재조합 EbCtB 발현백터를 E. Coli strain BL21(DE3)에 구축하기 위해, E. burgeri procathepsin B 서열이 포함된 서열에 BamHI/XhoI restriction sites (underlined)를 이용해 프라이머를 구축하여 다음 프라이머 서열을 제작하여, EcoRI-proEbCtB-F, 5'-CCCGGGATCCCAATGTATTCCACCACCCCCAC-3'; XhoI-proEbCtB-R, 5'-CCGCTCGAGTCATCT AAGTTTTGGAGTCCCAGC-3') PCR을 한 후, 다음과 같은 969bp의 단편을 pGEX-4T-1 (Amersham Pharmacia Biotech)에 삽입하였다. 재조합 플라스미드인 proEbCtB/pGEC4T-1을 E. coli strain BL21(DE3)에 형질전환하였다. 형질전환된 세포는 암페실린 (50g/ml)이 함유된 LB배지에서 약 3시간동안 37 ℃에서 배양한 후, Isopropyl-D-thiogalactopyranoside (IPTG)를 최종농도 0.4mM가 되도록 첨가한 후 20℃에서 약 6시간을 배양했다. 과발현된 세포는 수확하여, phosphate buffered saline (PBS)에 재현탁시킨 후, sonicator (Vibra cell, Sonics & materials Inc, USA)를 이용해 세포를 파괴시킨 다음 4℃에서 20,000g의 속도로 20분간 원심분리하였다. 그 후 glutathione S-transferase (GST)분리를 위해 4℃에서 glutathione-Sepharose 4B column (Pharmacia Biotech Co., USA)를 이용해 proEbCtL를 추출하였다. 추출된 단백질은 Centrifugal Filters Centriprep 30K devices (Merrck Millipore)를 이용해 추출된 단백질을 농축하였다.

정제된 proEbCtB 단백질은 12% SDS-PAGE gel에 loading하여 Commassie brilliant blue R-250로 염색하였다. Western blotting은 Prestaind molecular weight markers (Bio-Rad, USA)를 Standard로 하여 gel을 전기영동 한 다음 mouse monoclonal anti-GST antibody (1:2000, Santa Cruz Biotechnology)을 이용하여 수행되었다.

EbCtB의 단백질 활성은 Barret and Kirschke의 변형 방법에 따라 분석되었다(Barrett, Alan J., and Heidrun Kirschke., 1981).

Microplate Fluorometer (Packard Co. USA) excitation wavelength 380nm, emission wavelength 460nm를 이용하여 7-amido-4methylcoumarin(AMC)를 측정하였다. 효소 활성의 최적 pH는 기질인 Z-Phe-ARG-AMC를 이용하여 100mM sodium acetate buffer에서 pH 3-11 범위에서 측정하였다. 이를 바탕으로 다양한 기질, 저해제, 금속이온, 계면활성제를 이용하여 Assay를 진행하였다.

먹장어 카텝신 B의 유전자 서열을 밝히기 위해, 먹장어 조직에서 추출한 total RNA로부터 합성한 cDNA를 사용하여 PCR을 진행하였다. 먼저, 일부 서열을 밝히기 위해 National Center for Biotechnology Information (NCBI)로부터 타종의 카텝신 B 유전자들을 이용해 degenerated primer를 제작하였다. 이를 통해 밝혀진 서열을 이용해 각각 5‘-RACE (Rapid Amplification of cDNA End) PCR (Polymerase Chain Reaction)와 3’-RACE PCR을 진행하였다.

클로닝 결과, 먹장어 카텝신 B의 염기서열 길이는 총 1694 bp 였으며, 5‘-UTR은 107 bp, 3’-UTR은 585 bp의 길이를 가지고 있었다. 또한, ORF는 1002 bp로 총 333개의 아미노산의 정보를 가지고 있었다([Fig. 1]). 이로부터 나오는 먹장어 카텝신 B의 분자량은 약 36.8 kDa으로 밝혀졌다.

[Fig 1] 
Full nucleotide and amino acid sequences of EbCtsB

먹장어 카텝신 B의 시그널 펩타이드(Signal peptide), 프로 펩타이드(Pro peptide), mature peptide를 알기 위해 분석을 실시하였다. 분석 결과, 1번째 메티오닌(Methionine)부터 20번째 프롤린(Proline)까지가 시그널 펩타이드, 21번째 프롤린(Proline)부터 80번째 글루탐산(Glutamic acid)까지 프로 펩타이드, 81번째 류신(Leucine)부터 333번째 아르기닌(Arginine)까지가 mature peptide로 밝혀졌다([Fig 2]).

[Fig 2] 
Comparison of amino acid sequences between EbCtsB and other species CtsB. Red lines indicate cleavage site. Black arrows indicate end site of signal peptide and start site of pro peptide and mature peptide, respectively. Red boxes indicate active site.

아미노산의 서열 유사성 분석을 위해 NCBI genebank로부터 연어(Salmo salar), 넙치(Paralichthys olivaceus), 부세(Larimichthys crocea), 닭(Gallus gallus), 제브라피쉬(Danio rerio), 잉어(Cyprinus carpio), 캐롤리나 애놀(Anolis carolinensis)의 카텝신 B 아미노산 서열을 얻었다. 이를 이용해 타종의 카텝신 B와 먹장어 카텝신 B의 아미노산 서열의 유사성을 비교하였다. 비교 결과, GNFD motif 중 글리신(Glycine), 아스파라긴(Asparagine), 페닐알라닌(Phenylalanine)은 동일한 아미노산을 가지고 있었지만, 아스파르트산(Aspartic acid) 자리에는 프롤린(Proline)이 존재하였다. 또한, 활성부위(Active site)인 시스테인(Cystein), 글루탐산(Glutamic acid), 아스파라긴(Asparagine)은 다른 종과 일치하는 아미노산을 가지고 있었다.

계통학적 분석을 위해 다른 종의 프로테아제(Protease) 아미노산 서열을 NCBI로부터 얻었다. 프로테아제의 아웃그룹(Out group)으로는 아스파르트산 프로테아제(Aspartic protease)와 세린 프로테아제(Serine protease)를 사용하였다. 또, 카텝신 B-like의 아웃그룹으로는 카텝신 L-like를 사용하였다.

계통학적 분석 결과, 먹장어의 카텝신 B는 다른 종의 시스테인 프로테아제(Cysteine protease)와 같은 계통이며, 그 중, 카텝신 B와 한 그룹으로 묶이는 것을 확인하였다([Fig 3]).

[Fig 3] 
Result of phylogentic tree analysis.

먹장어 카텝신 B의 재조합 단백질(Recombinant protein)을 발현 후 정제를 하였다. 균주는 대장균(Escherichia coli) BL21(DE3)를 사용하였고, 재조합 단백질 정제를 위해서는 glutathione S-transferase (GST)를 이용한 친화성 크로마토그래피(Affinity chromatography) 방법을 사용하였다. 정제된 단백질 확인은 SDS-PAGE와 western blotting하여 60 Kda의 재조합 단백질을 확인하였다([Fig 4]).

[Fig. 4] 
Expression and purification of recombinant proEbCtB. (A) Protein samples were separated by 12% SDS–PAGE and were visualized Coomassie R-250 blue staining. (B) Western blotting analysis of the SDS–PAGE separated proteins using monoclonal anti-GST antibody. Lane M, standard size marker; lane 1, whole cell lysate of E. coli BL21(DE3) with expression vector (pGEX 4T-1-Self); lane 2, whole cell lysate from 0.4mM IPTG-induced GST expressing E. coli BL21(DE3) with expression vector (pGEX 4T-1-Self); lane 3, whole cell lysate from IPTG-not induced EbCtB-expressing E. coli cells; lane 4, whole cell lysate from 0.4mM IPTG-induced proEbCtB-expressing E. coli cells; lane 5, purified proEbCtB protein. The asterisk (*) indicates the purified proEbCtB protein (60 kDa).

정제된 재조합 단백질을 사용하여 다양한 pH, 기질(Substrate), 저해제(Inhibitor), 금속이온(Metal ion) 및 계면활성제(Detergent) 조건에 따라 먹장어 카텐신 B의 활성을 측정하였다.

우선, pH의 조건은 pH 3부터 pH 11까지 0.5 간격으로 측정하였으며, 기질은 Z-RR-AMC와 Z-FR-AMC를 사용하였다. Z-RR-AMC의 경우, pH 3부터 pH 5까지는 큰 변화가 없다가, pH 5.5부터 활성이 증가하여 pH 7.5에서 가장 좋은 활성을 보였다([Fig 5a]). Z-FR-AMC는 pH 4부터 활성이 증가하여 pH 8에서 가장 좋은 활성을 보였다([Fig 5b]).

[Fig 5] 
Activity of EbCtsB in diverse pH conditions. (a) Result of using Z-RR-AMC as substrate. (b) Result of using Z-FR-AMC as substrate

다양한 기질 조건에는 기질로 Z-FR-AMC, Z-RR-AMC, Z-GPR-AMC, Z-LLE-AMC, Z-AAF-AMC, Z-GGR-AMC, MeOSuC-AAPV-AMC, SVC-LLVY-AMC, Bz-RGFFP-4MeOβNA를 사용하였다. Z-RR-AMC를 사용했을 때, 먹장어 카텝신 B의 활성이 가장 좋았고, Bz-RGFFP-4MeOβNA를 기질로 사용하였을 때가 가장 나쁜 활성을 나타내었다([Fig 6]).

[Fig 6] 
Activity of EbCtsB in diverse substrates.

저해제로는 E-64, Antipain, Chymostain, NEM, PMSF, Aprotinin, EDTA, EGTA, Pepstatin A를 사용하여 실험하였다. 가장 강력한 저해제로 antipain이 작용하였고, E-64와 EGTA가 가장 약한 저해제로 작용하였다([Fig 7]).

[Fig 7] 
Activity of EbCtsB in diverse inhibitors

마지막으로 금속이온으로 ZnSO₄, CuSO₄, MgSO₄, HgCl₂, CaCl₂, KCl을 사용하였다. 또, 계면활성제는 Triton X-100, Tween 20, SDS, Brij35를 사용하였다. 각각의 금속이온과 계면활성제는 10mM과 50mM의 두 가지의 농도로 처리하여 실험을 진행하였다. 먼저, 10mM의 농도에서 MgSO₄와 Tween 20 처리조건에서 먹장어 카텝신 B의 활성이 크게 바뀌지 않았고, ZnSO₄와 SDS 처리 조건에서 활성이 크게 감소하였다([Fig 8a]). 50mM의 농도에서는 10mM의 농도와 비교하였을 때 전체적인 경향은 비슷하게 보이지만 활성과 억제의 효과가 더욱 강하게 나타났다([Fig 8b]).

[Fig 8] 
Activity of EbCtsB in diverse metal ions and detergents. (a) Result of using 10mM concentration. (b) Result of using 50mM concentration.